PCR - polimeráz láncreakció - Ez egy modern, nagy pontosságú diagnosztikai módszer, amely a molekuláris biológia eredményein alapszik és lehetővé teszi a betegségek teljes spektrumának kórokozóinak kimutatását oly módon, hogy a DNS bizonyos szakaszát az enzimek hatására, mesterségesen létrehozott körülmények között (in vitro) ismételten megduplázva.

Ennek eredményeként csak azokat a szakaszokat másolják, amelyek megfelelnek a meghatározott követelményeknek, és csak azokban az esetekben, amikor rendelkezésre állnak az elemzett mintában. A betegség forrásainak azonosításához elegendő, ha a minta legalább néhány e kórokozó DNS-molekuláját tartalmazza.

A PCR-t leggyakrabban a nemi és urológiai betegségek diagnosztizálására használják. A szokásos, megfizethető áron végzett tanulmánykészlet általában magában foglalja a 12 kóros betegség okozóinak azonosítására szolgáló tesztek kinevezését.

Hogyan hajtják végre a PCR-t?

A PCR-elemzés számos betegség baktériumát fedezi fel. Az orvosi klinikákon a tanulmányok komplexumába általában beletartoznak a következő baktériumok forrásainak azonosítása:

• chlamydia
• hepatitis B és C;
• mycoplasmosis;
• ureaplasmosis;
• gardnerellosis (bakteriális vaginosis);
• rigó (candidiasis);
• fertőző mononukleózis;
• trichomoniasis;
• HPV (humán papillomavírus);
• tuberkulózis;
• herpeszvírus;
• HIV AIDS).

A manipuláció előkészítése előtt be kell tartani néhány korlátozást. A tervezett eljárás időpontját megelőző napon el kell utasítania a szexet, ne duzzadjon és ne jelentkezzen be gyógyszerek (antibiotikumok, gyulladáscsökkentők stb.). Reggel előestéjén nem lehet reggelizni és italokat inni. A férfiaknak 2 órával a vizsgálat előtt tartózkodniuk kell a vizelésből. A végrehajtás során a húgycső nyálkahártya hámsejtjeit kaparják (férfi betegek esetén) vagy méhnyakcsatorna méhnyak (nőknél). Az anyagmintavételt steril körülmények között, speciális eszközökkel hajtják végre.

A kinevezés indikációi

• szokatlan (túl vastag, bőséges) ürítés a nemi traktusból;
• viszketés, égés és fájdalom megjelenése az intim szervek területén;
• egy ideig véletlen szexuális kapcsolat után egy véletlenszerű partnerrel;
• a kezelés hatékonyságának figyelemmel kísérése érdekében;
• a urogenitális szervek műtéti kezelése előtt;
• a meddőség vagy vetélés okának megállapítása.

A kezelés alapelvei

A 12 fertőzés PCR-eredményét két nappal azután kaphatjuk, hogy kenet veszünk elemzésre. Nál nél egészséges ember a fenti betegségeknek a szervezetben való fertőzésének hiányozni kell.

Ha bármilyen fertőzést észlelnek, a kezelést kizárólag az orvos írhatja elő, aki kiírta a vizsgálatot. Az orvosi ajánlások végrehajtásának folyamatában szigorúan be kell tartani az összes pontot, és az előírt ideig a gyógyszereket a szükséges adagokban kell bevennie. Ellenkező esetben lehetséges a betegség krónikus formává válása vagy súlyos szövődmények kialakulása.

Ellenjavallatok

Gyakorlatilag nincs olyan tényező, amely tiltaná a 12 fertőzés PCR-elemzését. A manipulációt egy kényelmesebb időre csak akkor lehet elhalasztani, ha a beteg rosszul érzi magát, vagy akut állapotban van más betegsége (például influenza).

A PCR 12, amelynek ára meglehetősen ésszerű, lehetővé teszi a veszélyes betegségek okozóinak időben történő felismerését és elkerüli a drágább kezelést igénylő szövődmények előfordulását.

Szolgáltatások a " Modern diagnosztika"

Klinikák a "Modern Diagnostics" irányába

»STD-k és a polimeráz láncreakció laboratóriumi diagnosztizálása (előadás)

Az STD-k és a polimeráz láncreakció laboratóriumi diagnosztizálása (előadás)

ph.D. Pokrovskaya M.S.
Corr. RAMS, prof. Smirnov G.B.
(NIIEM őket. NF Gamalei RAMS és JSC "LAGIS")

Bevezetés

Régóta köztudott, hogy a beteg gyógyításához tudnia kell, hogy pontosan mikor beteg. A betegség típusának meghatározásának folyamatát diagnózisnak hívják. Bármely betegséget diagnosztizál az orvos (az anamnézis vizsgálata, a klinikai tünetek megfigyelése és a laboratóriumi adatok elemzése alapján), majd a kezelést írja elő. Manapság a diagnózis felállításakor az orvos laboratóriumi vizsgálatok adatait használja, amelyek nélkül vagy nehéz a helyes diagnosztizálás, vagy bizonyos esetekben általában lehetetlen.

A diagnózisnak a betegségek felismerésének folyamataként az a jelentősége, hogy a korai, pontos diagnózis az ésszerű és hatékony kezelés alapja, amely a legtöbb esetben lehetővé teszi a lehetséges lehetőségek a betegség további lefolyása és kimenetele.

A fertőző betegségek diagnosztizálásában, ideértve a Az STD-k fontosak az etiológiai tényező (kórokozó) azonosításához és a betegség stádiumának meghatározásához, vagyis az etiotróp és megfelelő terápia kiválasztásához szükséges információk megszerzéséhez, a betegség lefolyásának és befejezésének ütemezéséhez.

A modern jellegzetességei laboratóriumi diagnosztika folyamatos új fejlesztések, valamint az ismert módszerek és technikák fejlesztése. Ennek oka az a tény, hogy a az elmúlt évtizedekben folyamatosan változnak mind a fertőző betegségek klinikai képe, mind azok patogenezisének jellemzői. Például a jól ismert, nagyon veszélyes kórokozók okozhatják a betegségek törölt formáit és fordítva: a feltételesen patogén vagy tekinthető patogén mikroorganizmusok súlyos formákat okozhatnak. A patogén mikroorganizmusok tropizmusa megváltozik (más szerveket és szöveteket érint) és ennek eredményeként a fertőző folyamatok új formái jelentkeznek. Vannak krónikus, tartós fertőzési formák, és a kórokozók antigén szerkezete megváltozik, a mikroorganizmusok nem termesztett állapotba kerülnek. A fertőző betegségek lefolyásának klasszikus formáitól való eltérés és az atipikus formák előfordulása két körülményhez kapcsolódik. Először is, az immunrendszer állapota megváltozott a lakosság egy részén, az immunhiányos állapotok általánosok különböző természetű. Másodszor, maguk a kórokozók változnak. Vagyis a mikroorganizmusok evolúciós folyamatának tanúi vagyunk.

Mindez bonyolítja a diagnózist és hátrányosan befolyásolja a kezelés hatékonyságát. A használat szerepe modern módszerek A diagnosztikai laboratóriumi kutatások jelenleg nagyon jelentősek.

A fertőző betegségek diagnosztizálására különféle laboratóriumi és műszeres módszereket alkalmaznak, amelyek közül a legfontosabb a hely speciális módszereka betegség kórokozójának azonosítása és etiológiai diagnózis felállítása céljából.

Az üzenet tárgya a fertőző betegségek laboratóriumi diagnosztikájának kiválasztott szakaszai.

A fertőzések laboratóriumi diagnosztizálásának alapelvei és módszerei

A laboratóriumi diagnosztika kulcsfontosságú mutatói a fertőzések kórokozóinak (gombák, protozoák, baktériumok és vírusok) azonosítására szolgáló módszerek érzékenysége és specifikása.

• Érzékenység- ez a minimális anyagmennyiség, amelyet ezzel a módszerrel lehet kimutatni. Az anyag lehet egész mikroorganizmus és a patogénmolekulák fragmentumai, valamint az emberi test által a fertőzés hatására előállított specifikus antitestek. Minél kevesebb anyagot képes észlelni egy módszer, annál nagyobb az érzékenysége. Ha egy laboratóriumi vizsgálat nem támasztja alá a mintában lévő mikroorganizmusokat, amelyek kimutatására tesztrendszert fejlesztettek ki, az eredményt hamis negatívnak nevezik. Minél nagyobb a módszer érzékenysége, annál kevésbé lesz a hamis-negatív [hamis (-)] eredmény.
• sajátosság- ez a módszer azon képessége, hogy jelzi a mintában csak annak a tárgynak a jelenlétét, amelynek detektálására tesztrendszert fejlesztettek ki. Ha a módszer jelzi a mintában olyan mikroorganizmusok jelenlétét, amelyek nem tartalmaznak ott, az eredményt hamis pozitívnak nevezik. Minél nagyobb a módszer specifikása, annál kevésbé van a hamis pozitív [hamis (+)] eredmény.

  A laboratóriumi diagnosztika összes módszerét két csoportra lehet osztani: a mikroorganizmusok közvetlen és közvetett kimutatásának módszerei.

• Közvetlen módszerekígy nevezték el, mert közvetlenül azonosítják a fertőzés kórokozóit vagy az anyagot, amely a kórokozó részét képezi, vagy az általa termelt. Ezek általában antigének vagy genetikai anyagok. A közvetlen módszerek magukban foglalják a következőket (1. táblázat):

  1. táblázat: Közvetlen laboratóriumi diagnosztikai módszerek
  Mód	A módszer elve	sajátosság	Érzékenység
  mikrobiológiai	A kórokozó tiszta tenyészetének izolálása	100% arany standard laboratóriumi diagnosztika	1000-10 000 sejt / ml
  Citológiai (mikroszkópia)	Festett kenet-teszt	20-80%	1000-100 000 sejt / ml
  Immuncitológiai és szerológiai	Az antigének azonosítása az antitestekhez való kötés után RIF, ELISA	70-90%	1000-100 000 sejt / ml
  Molekuláris biológiai	Egy specifikus DNS / RNS régió meghatározása a kórokozó genomjában	99–100% felel meg az „arany szabványnak”	200 sejt / ml (1 sejt reakciónként)

  A hamis (+) eredményeket a citológiai módszer esetében az eredmények kiértékelésének szubjektivitásával, immunológiai módszerek esetén - az antigének antitestekkel keresztreakciójával társítják.

  A közvetlen módszerek hamis (-) eredményei a kórokozó hozzáférhetetlenségének okai lehetnek a klinikai anyag gyűjtése során, a mikrobiológiai módszernél - egy mikroorganizmus halálánál a minta szállítása során és nem művelt forma esetén.

• Közvetett módszerekazért nevezték el, mert az anyagot nem maga a kórokozó, hanem az emberek által a fertőzés hatására előállított specifikus antitestek detektálják ilyen típusú, azaz immunológiai. Ilyen módszerek a következők: bókkötő reakció (CSC), közvetett immunfluoreszcencia reakció (RNIF), mikroimmunfluoreszcencia reakció (MIF), rekombináns lipopoliszacharid ELISA (r - ELISA), enzim immunoassay (ELISA). Ezeknek a módszereknek az érzékenysége 1000-100000 sejt / ml.

  Ha szinte minden esetben immunológiai módszereket alkalmazunk, akkor a hamis (+) eredmények az antitestek nem specifikus antigénekhez történő kötődésével vagy az antigének antitestekkel történő keresztreakciójával járnak. Hamis (-) eredmények a mintában levő nem megfelelő számú antitest vagy antigén, valamint a meghatározási módszerek elégtelen érzékenysége miatt merülnek fel.

  A modern laboratóriumi diagnosztika jelentős sikere ellenére a gyakorlatban egyetlen módszer sem garantálja a 100% -os érzékenység és a specifikusság kombinációját. Ez azt jelenti, hogy nem ad 100% -ban helyes választ. Ezért a diagnózis megállapításához az orvosnak gyakran legalább kettőt kell használnia különféle módszerek, és mindegyik vizsgálatot a legjobb elvégezni másolatban vagy három példányban. Ez követelmény olyan betegségek diagnosztizálásában, mint például a tuberkulózis, a chlamydia és néhány más betegség (1).

Az A, M, G osztályú immunglobulinok kimutatásának diagnosztikai értéke

Nézzünk részletesebben a szerológiai diagnosztikára (az antitestek meghatározása a vér szérumában ELISA-val). Ennek alapja a nagyon specifikus antitestek (antitestek) meghatározása, amelyek az emberi testben mikroorganizmusok - fertőzések kórokozói - jelenlétére reagálva alakulnak ki. Ezek az antitestek az M, A és G osztályú immunglobulinok (Ig). Az antitestek az antigénekkel való kölcsönhatás révén semlegesítik a fertőző ágenseket. Az antigén a fertőző szer (mikroorganizmus) specifikus része, amely specifikus antitestek képződését okozza az emberi testben (immunválasz). A szerológiai reakciók alapja az antigén-antitest specifikus kölcsönhatása. Fontolja meg, hogy a diagnózis milyen eredményeket mutat az IgM, IgA, IgG osztályok antitestjeinek kimutatására (2. táblázat).

2. táblázat: A fertőző betegség stádiumának meghatározása a vér szérumban lévő antitestek ELISA módszerrel végzett vizsgálatának eredményei alapján
A betegség stádiuma (formája)	Antitestek a vérszérumban megjelenésük sorrendje szerint	Cím dinamika (2-3 hét alatt)
Akut az elsődleges fertőzésnél	IgM ⇒ IgG ⇒ IgA vagy - IgM ⇒ IgA ⇒ IgG ⇒ korai vagy korai IgG	A titerek növekedése vagy csökkenése (IgM a 7. nap után), a fertőzés kezdete óta eltelt idő függvényében
Másodlagos fertőzés és újraaktiváció (visszaesés)	IgG ⇒ IgA, IgM szinte teljes hiánya ⇒ korai vagy korai IgG	A titerek gyors növekedése vagy csökkenése
Krónikus	IgG ⇒ IgA, néha csak IgA vagy csak IgG	Az állandó alacsony titerek állandóan magasak lehetnek - súlyos emelkedő fertőzés vagy szisztémás léziók esetén.
Perzisztencia, szállítás	IgA vagy IgG	Állandó (több hét) alacsony titerek (antitesteket nem mindig észlelnek a mikroorganizmusok megváltozott antigénszerkezete miatt)
Régóta fennálló betegség	IgG	Állandóan alacsony titerek

Különböző osztályú antitestek mennyiségi meghatározása segít meghatározni a betegség stádiumát és jellegét. A mennyiségi eredmények értelmezésekor figyelembe kell venni az immunválaszt az emberi test a fertőzés kialakulása és az általa előállított antitestek szintje a kórokozók tulajdonságaitól, a fertőzés folyamatától és az immunrendszer egyedi jellemzőitől függ. Súlyos immunszuppresszió esetén az AT szintézis teljes mértékben elnyomható. Ezért a diagnózis felállításához, különösen atipikus fertőzési formák esetén, az orvos nem tudja egyértelműen értelmezni egy vizsgálat kvantitatív eredményét.

A különféle fertőző kórokozókkal szembeni antitestek kvantitatív kimutatásának eredményeinek helyes értékeléséhez a páros szérum elvét kell alkalmazni (2-3 hét után ismételjük meg a vizsgálatot, és hasonlítsuk össze az eredményeket). Az ilyen vizsgálatok lehetőséget teremtenek az ellenanyagok kimutatásának dinamikájának elemzésére, és ezáltal a kinyerésre szükséges információ a fertőző folyamat fejlődéséről. Az antitestek négyszeres növekedése 2-3 hét alatt a fertőzés kialakulását jelzi.

Pontosan ahhoz, hogy ilyen páros vizsgálatokat le lehessen végezni, szükség van kvantitatív ELISA eredményekre.

Az akut fertőzés meghatározásának hagyományos módja az IgM kimutatása a szérumban. A modern diagnosztikai tesztrendszerek lehetővé teszik az IgM mellett más korai antitestek kimutatását is, például: 1) IgG korai vírusok elleni IgG és 2) alacsony aviditású IgG. Ezenkívül a vírusok korai fehérjéihez kapcsolódó IgG mind az elsődleges akut fertőzés, mind a relapszus (krónikus fertőzés súlyosbodása), mind az újrafertőzés, azaz az akut fertőzés minden variációja, szemben az IgM-mel, általában csak primer fertőzéssel termelődik.

Polimeráz láncreakció

A molekuláris diagnosztikai módszerek orvosi mikrobiológiai gyakorlatának bevezetése természetesen jelentős esemény volt, mivel radikálisan kibővítette a betegségek patogenezisének tanulmányozásának lehetőségeit, alapvetően javította a diagnózist, és felvázolta a kezelés új megközelítéseit is. A PCR-en alapuló molekuláris diagnosztika módszere, amely a nagy érzékenység és a specifitás optimális kombinációját biztosítja, egyre gyakoribb.

A molekuláris diagnosztika általában, és különösen a PCR alapja a specifikus antitestek jelenlétének meghatározása nukleinsavak, leggyakrabban a DNS.

A DNS egy kétszálú (kétszálú) polimer molekula, amelynek nukleotidszekvenciája meghatározza a test összes tulajdonságát. A sejtosztódás során a DNS megduplázódik, és a szülősejt genetikai anyagának pontos másolata belép a két lánysejtbe. A DNS-molekula megduplázódását replikációnak nevezzük. Két kezdeti (mátrix) DNS-láncon új (a mátrixot kiegészítő) lányláncok épülnek. A replikációt egy enzimatikus komplex biztosítja, amelynek kulcseleme a DNS-polimeráz. Annak érdekében, hogy a DNS-polimeráz replikálni kezdjen rajta, a mátrixon kívül magra (primerre) is szükség van - egy kis DNS-fragmens, amely komplementer a mátrixszal. Ez a mag DNS-polimeráz meghosszabbodik, új DNS-szálat építve a meglévő mátrixra. Általában a sejtben vagy a vírusban az összes DNS replikálódik a természetben, és ennek a folyamatnak az eredménye az eredeti DNS két azonos példánya.

Most, hogy röviden emlékeztettünk a replikáció legfontosabb dolgára, folytathatjuk a polimeráz láncreakció leírását. A PCR-t 1983-ban nyitották meg, és ma már széles körben használják tudományos és gyakorlati kutatásokhoz a fertőző és genetikai betegségek diagnosztizálása, valamint egyes onkológiai patológiák korai diagnosztizálása területén. Ennek a módszernek a felfedezéséért Carey Mullis 1995-ben elnyerte a legrangosabb tudományos díjat - a Nobel-díjat.

A reakció során a DNS-t is replikálják, de a természetben nem szokásos módon. Először is, a mikroorganizmus nem az összes DNS-é replikálódik, hanem csak annak kis fragmentuma (célpontja).

Másodszor, a PCR termék nem két, hanem az eredeti célpont millióinak példánya. Ezt a többszörös replikációt amplifikációnak nevezzük.

Nál nél különböző fajták A baktériumfajok, valamint a vírusok, a genetikai szövegek (a DNS nukleotidszekvenciái) különböznek. Modern számítógépes programok tartalmaznak egy adatbázist a különféle szervezetek dekódolt DNS szekvenciáiról. A diagnosztikai PCR tesztrendszer kidolgozásakor kicsi DNS-fragmenst (célpontot) találunk, amely szigorúan specifikus egy adott patogénre. PCR alkalmazásával ezt a régiót amplifikáljuk, majd az amplifikációs terméket (amplikon) agaróz gélelektroforézissel azonosítjuk.

Egy adott mikroorganizmus specifikus DNS-fragmentumának azonosításával ezáltal meghatározzuk a mikroorganizmust.

A fertőzés diagnosztizálásának minden ciklusa három szakaszban megy végbe (ábra):

1. A denaturáció - a kétszálú DNS-láncok szövése - nem enzimes folyamat, amely 95 ° C hőmérsékleten zajlik le.
2. Alapok csatlakozása (lágyítása). A replikációs folyamat elindításához PCR-ben primereket használunk - rövid egyszálú (15-30 bázis hosszú) DNS-eket, amelyeket feleslegben adunk a reakcióelegyhez. Különösen (a komplementer párosítás elvének megfelelően) a kiválasztott célt megkötő rövid szakaszokhoz kapcsolódnak. Ez a szakasz nem enzimes és a reakcióelegy 55-65 ° C hőmérsékleten történő inkubálása során megy végbe. A primerek csak az e kórokozóra specifikus kiválasztott DNS-fragmentumokhoz kapcsolódnak, és nem lépnek kölcsönhatásba más DNS-szekvenciákkal (és egy klinikai mintában sok a DNS, mint egy embernél) és különféle mikroorganizmusok). Ez biztosítja a diagnosztikai PCR tesztrendszer abszolút specifitását. A templát-DNS-rel szembeni fölösleges DNS-primerek biztosítják a módszer nagy érzékenységét. Vagyis a kezdeti PCR-oldatban található primerek 100% -ban valószínűleg megtalálják a kötődés célpontját.
3. A láncindítók hozzáadása eredményeként kialakulnak a [DNS-mátrix + primer] struktúrák, amelyek „mag” komplexek. A primerek teljes kialakulása a 3 végétől kezdődik, amikor az egyszálú DNS-fragmenseket a mátrixokon komplementer szintetizálják. Ezt a folyamatot egy speciális enzim - Taq polimeráz (hőálló DNS polimeráz) és nukleotidok (építőanyagként) segítségével hajtják végre.

   Az újonnan szintetizált kettős szálú DNS a denaturálási lépés után ismét olyan primerekhez kötődik, amelyek feleslegben vannak a keverékben. A kapott struktúrák a befejezés után specifikus DNS-fragmenseket képeznek, amelyeket primer szekvenciák korlátoznak. Így még akkor is, ha csak egy DNS-molekula volt a PCR kiindulási pontja, az amplifikáció 25–40 cikluson belül zajlik, azaz szintetizált nagyszámú (108-109 példány) specifikus DNS-fragmensek (amplikonok), amelyek elegendőek az agaróz-gél elektroforézis utáni reakció eredményének vizuális felvételéhez.

A PCR-t egy ciklátorban vagy thermocycler - olyan eszköz, amelyben az előre meghatározott hőmérséklet-változási mód ciklikusan automatikusan végrehajtódik, lehetővé téve, hogy több szakasz többször áthaladjon az 1., 2., 3. szakaszon.

A reakciót agaróz gél elektroforézissel hajtjuk végre. A negatívan töltött DNS-molekulák a gélben mozognak elektromos mező a katódtól az anódig, míg a DNS-fragmensek út hossza egy bizonyos ideig a méretüktől függ. A gélben lévő DNS-t etidium-bromiddal festették, amely ultraibolya fényben láthatóvá teszi. Ha az amplikonok (azonos méretű DNS-fragmensek) a vizsgálati mintában felhalmozódnak a PCR eredményeként, akkor azok ugyanolyan távolságra vannak a kezdettől, és csíkként lesznek láthatóak a gélpályán. Ha a csík helyzete a gélpályán megegyezik a használt primerek számára kiszámított értékkel, azaz ugyanolyan távolságra van a kezdetektől, mint a pozitív kontroll csíkja, ez azt jelenti, hogy a vizsgálat eredménye pozitív.

Mint minden kísérletnél, a PCR eredményeinek figyelembevételekor a kontroll - pozitív és negatív - is rendelkezésre áll. Minden diagnosztikai tesztrendszernek jóváhagyott előírásokkal kell rendelkeznie, amelyek tartalmazzák az említett kezelőszervek jelenlétét.

A pozitív kontroll egy minta, amely DNS-templáttal rendelkezik az azonosított mikroorganizmusnak megfelelő specifikus amplikon felhalmozódására.

A negatív kontroll a víz, az emberi DNS vagy a meghatározott tesztrendszerhez szorosan kapcsolódó mikroorganizmusok DNS-e.

A PCR módszer előnyei

A PCR-diagnosztika az egyik legmodernebb és legfejlettebb laboratóriumi diagnosztikai módszer, amely lehetővé teszi a mintában a fertőző betegség kórokozóinak egyetlen sejtjének DNS-ének specifikus kimutatását.

van alapvető különbség molekuláris diagnosztikai módszerek, beleértve a PCR-t, bármely más hagyományos módszerből. Ez a különbség az, hogy a hagyományos módszerek feltárják a mikroorganizmusok gének (fehérjék, antigének és összetettebb szervezett karakterek) aktivitását, míg a PCR közvetlenül a genetikai anyagot fedezi fel. Így a mikroorganizmust PCR-rel detektálják, függetlenül a genom működésének jellemzőitől, bármilyen atipikus megnyilvánulástól.

Azt mondhatjuk, hogy a PCR eléri a lehető legnagyobb érzékenységet. A PCR tesztrendszerek érzékenysége 10-1000 sejt egy mintában, míg az immunológiai és mikroszkopikus módszerek érzékenysége a mintában 1000-100000 sejt. Magas érzékenysége miatt a PCR-alapú tesztrendszerek nélkülözhetetlenek azokban az esetekben, amikor a vizsgált anyag (kórokozó) nagyon kicsi.

Magas érzékenysége miatt a PCR-teszt lehetővé teszi korai diagnózis betegségek (pl rutin vizsgálatok populáció), az antibiotikumterápia hátterének diagnosztizálása, a gyógyulás (a kezelés hatékonysága) ellenőrzése, valamint a perzisztens mikroorganizmusok kimutatása. Egyes patogének, például a Mycoplasma hominis, az Ureaplasma urealiticum, a Gardnerella vaginalis és a Candida albicans esetében a diagnosztikus PCR tesztrendszerek érzékenysége nem lehet magas. Az érzékenységi mutatókat speciálisan fejlesztették ki és hagyták jóvá, kezdve 105–6 sejt / ml-en. Az ilyen tesztrendszerek diagnosztikailag jelentős mennyiségű mikroorganizmust észlelnek (2,3).

A kórokozó mikroorganizmusok nehezen termesztett, nem művelt és tartósan fennálló formáinak azonosításakor csak a patogén DNS-jét kimutató közvetlen módszer biztosítja a szükséges diagnosztikai választ. Más diagnosztikai módszerek (immunológiai, bakteriológiai, mikroszkópos) nehézek vagy akár lehetetlenek. Perzisztens mikroorganizmusok esetében ennek oka lehet a kórokozók antigénszerkezetében bekövetkező változások vagy az ilyen mikroorganizmusok nem tenyésztett formává történő átalakulása. Ezt a latens és krónikus fertőzések diagnosztizálásakor nem szabad elfelejteni.

A PCR módszer magas specificitását a primerek nukleotidszekvenciája és azoknak a kórokozóra specifikus DNS-fragmentumhoz (célponthoz) való kapcsolódásának feltételei határozzák meg, amelyeket kifejezetten a PCR tesztrendszer létrehozásakor dolgoztak ki. A választott primerektől függően a PCR tesztrendszer megkülönböztetheti ugyanazon faj mikroorganizmusainak nemzetségeit, fajait, szerotípusait, sőt akár patogén és nem patogén törzseit is.

A fertőzések diagnosztizálására a PCR segítségével meghatározható a kórokozók érzékenysége (vagy rezisztenciája) sok alkalmazott antibiotikummal szemben. Különösen igaz ez azokra az esetekre, amikor a mikrobiológiai kutatási módszer alkalmazása nem lehetséges.

Bármely olyan klinikai anyag, amely potenciálisan a fertőzések kórokozóit tartalmazza, alkalmas a PCR elemzésre - vér, szérum, mosófolyadék, köpet, nyál, gyomornedv, biopsziás anyag, kenet, tampon. A vizsgált anyag lehet tárgyakból vett minta a külső környezet (mosások, ujjlenyomatok, kenet, víz, talaj stb.).

A PCR egységes és automatizált módszer, amely lehetővé teszi a 2006 - ban jóváhagyott előírások szabványos betartását engedélyek Ennek a PCR-tesztrendszernek a használata nagy pontosságot és az eredmények reprodukálhatóságát biztosítja.

PCR laboratóriumi diagnosztika - gyors és megbízható módon a fertőző betegségek kórokozóinak azonosítása. A PCR laboratórium az anyagnak a vizsgálathoz történő szállításától számított 48 órán belül választ ad. ( Tiszta idő az egyes minták vizsgálata csak néhány óra.)

Egy klinikai mintában több mint 20 kórokozó jelenléte egyidejűleg meghatározható.

A klinikai minta vizsgálatának fontos szempontja a megfelelés a klinikai anyag gyűjtésének és tárolásának szabályai. Íme néhány általános javaslat:

• A klinikai anyagot a mikroorganizmusok tervezett élőhelyéből és a fertőzés fejlődéséből veszik (ehhez figyelembe kell venni a bejárati kapukat, az elosztási útvonalakat, a szaporodási helyeket és a kívánt mikroorganizmusok izolálásának útvonalait).
• Az összegyűjtött anyagnak kis mennyiségűnek kell lennie (legfeljebb „gyufaszálgal”). A felesleges ürítés, a nyálka és a gennyek hátrányosan befolyásolják a DNS extrakció minőségét, és hozzájárulnak a DNS lebomlásához a tárolás és a szállítás során.
• A klinikai anyag gyűjtéséhez kizárólag egyszer használatos keféket vagy tamponokat használjon. Amikor a klinikai anyagot laboratóriumi kémcsőbe helyezik oldatával, ügyeljen a sterilitásra.

A molekuláris diagnosztika relevanciája

Az egyik leginkább feltűnő példák, amely a molekuláris diagnosztika relevanciáját bizonyítja, a magas onkogén kockázattal járó fertőzés kimutatása az emberi papillomavírusok által. Nem minden papilomavírus okoz rosszindulatú növekedést. Megkülönböztetni a nagy valószínűséggel rákot okozó vírusok genotípusait és az úgynevezett jóindulatú genotípusokat. Az elsők között szerepel a 16., 18. (a régiónkban általános), 26., 31., 33., 35., 39., 45., 51., 52., 55., 56., 58., 59., 68 (ME180), MM4 (W13B), MM7 ( P291) és MM9 (P238A). A jóindulatú genotípusok közé tartozik a 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66 és az MM8 (P155). A papillomavírus genotípusának azonosítása lehetséges, és PCR-rel végezzük (4,5).

A 16.18 típusú papillomavírus továbbra is fennáll a sejtekben laphám hám a méhnyak, évekig (legfeljebb 5 évig, az inkubációs periódusig) klinikai tüneteket nem okozva, amíg észrevehető daganatok kialakulnak. A korai diagnosztizálás ilyen esetekben csak a megelőző vizsgálatok populáció PCR-t használva. A nagy valószínűséggel rákot okozó papillomavírus-típusú DNS kimutatása esetén a betegnek konzultálnia kell onkológussal, havonta egyszer meglátogatnia, megfigyelnie a klinikai tüneteket. Így a PCR ebben az esetben lehetővé teszi a korai diagnózis elvégzését, amely segít megelőzni vagy meg nem kezdeni a méhnyakrákot.

Számos esetben a betegség bizonyos szakaszaiban a kórokozókat nem lehet megkülönböztetni klasszikus mikrobiológiai módszerekkel. Ennek oka az a tény, hogy a mikroorganizmusok elhelyezkedhetnek az epiteliális sejtekben, a szövetekben vagy a nyálkahártyában (például chlamydia, mycoplasmas, ureaplasmas, az összes vírust intracelluláris lokalizáció jellemzi, a trichomonadok és a gonococcusok lehetnek intracelluláris és extracellulárisak is). Ezenkívül egyes baktériumok bizonyos tényezők hatására átjuthatnak az úgynevezett nem termesztett formákba vagy nem kultúrált állapotba. Példa erre a chlamydia orvosi kutatása. A Chlamydia trachomatis fertőzés helyén történő kimutatásának időtartamát szövettenyésztési módszerek, közvetlen fluoreszcencia, PCR (DNS detektálás) és Western blot (RNS detektálás) módszerével hasonlítottuk össze. Megállapítást nyert, hogy a nukleinsavak meghatározására szolgáló módszerek a kórokozót a járvány kitörésekor 4 héttel hosszabb ideig (16 héttel szemben a kezdeti fertőzés után 12 héttel) detektálják, mint a hagyományos módszerek. Ebben a munkában következtetést vontak le a chlamydia átváltozásának lehetőségéről a fertőző folyamat során egy nem kulturált állapotba. Ebben az állapotban a chlamydia továbbra is gyulladást okoz vagy fennáll az epiteliális sejtekben, de a mikrobiológiai módszer nem ismeri fel (6).

Jelenleg sok anyag halmozott fel, amely jelzi a molekuláris diagnosztika relevanciáját, ám más példákat nem tekinthetünk a kiadvány korlátozott kötetének köszönhetően.

Stratégia laboratóriumi diagnosztikai módszerek alkalmazásához

A modern színpadon a fertőző betegségek laboratóriumi diagnosztikájának kidolgozása, az integrált megközelítés nyilvánvaló szükségessége, amely különféle laboratóriumi módszerek használatából áll a fertőző betegség etiológiai diagnosztikájának megállapításához. Az orvos a kórtörténet és a klinikai tünetek tanulmányozása után dönt egy adott laboratóriumi kutatási módszer alkalmazásáról. Különböző kombinációk A módszereket a kórokozók biológiai tulajdonságaitól és az emberi immunrendszerrel való kölcsönhatásuktól, valamint a betegség formájától függően alkalmazzák.

Például a chlamydia, herpeszvírusok, toxoplazmák laboratóriumi diagnosztizálására a PCR és az ELISA vizsgálatok eredményeit elemezzük. A mikoplazmózis és az ureaplasmosis laboratóriumi diagnosztizálásában a PCR kombinációját és a tenyészetek izolálását alkalmazzák az antibiotikumokkal szembeni érzékenység meghatározásával. A nem specifikus, feltételesen patogén mikroflóra azonosításához kenet mikroszkópiát és mikrobiológiai módszert alkalmaznak a tenyészetek izolálására.

A klinikus diagnosztizálást végez a beteg történetének, klinikai megnyilvánulásainak és laboratóriumi diagnosztikai adatoknak a alapján.

Irodalom:

• Szexuális úton terjedő fertőzések, 2. szám, 2002., 21–24. Urogenitalis chlamydialis fertőzés. A diagnózis és a kezelés megközelítései. G. A. Dmitriev, a TsNIKVI Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva.
• oktatói. Teljes orosz oktatási-tudományos-módszertani központ az orvosi és gyógyszerészeti továbbképzéshez. Moszkva, 1999. A hüvely mikroökológiája. A mikroflóra korrekciója hüvelyi dysbiosisban. V. M. Korshunov, ... L.I. Kafarskaya, ... V.V. Smeyanov. Az Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, RSMU, MIMSR, RMAPO, Moszkva.
• Szexuális úton terjedő fertőzések, 1. szám, 8-15. Oldal, 2002. Jelenlegi állapot az Ureaplasma urealiticum szerepe az urogenitális betegségek kialakulásában. BE ÉS. Kisina, O.S. Zagrebina, K.I. Zabirov, V.V. Sacks. Az Orosz Föderáció TSNIKVI Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva Egészségügyi Minisztérium 47. városi klinikai kórháza.
• Kialakulásában. Szerzők kollégája, szerkesztette D.G. Zaridze. Tudományos világ, 2000, Moszkva. Papillomavírusok és azok szerepe a méhnyak karcinogenezisében. F. L. Kiselev. Onkológiai Tudományos Központ Kost.
• Orvosi laboratóriumi diagnosztika (programok és algoritmusok). A könyvtár szerkesztette: prof.A.I. Karpishchenko, 2001, Intermedika, Szentpétervár.
• Megfertőzni. Immun., 1992. május, 2040-2047, Vol. 60, No. 5. Chlamidialis RNS és DNS kimutatása tenyésztési negatív állapotban. SM Holland, ... HR Taylor. Fertőző betegségek osztálya, Johns Hopkins Kórház, Baltimore, Maryland.

A biológiai PCR-hez különféle biológiai anyagok alkalmazhatók, amelyek mikrobákat vagy azok fragmentumait tartalmazhatják.

A nemi szervek férfiak és nők fertőzéseinek azonosítása, elemzés céljából a nemi szervekből történő ürítés, a kenet húgycsőkenet a méhnyakról, valamint a vizelet.

A vírusos hepatitis C és a HIV fertőzés diagnosztizálásához vért vesznek elemzésre.

A torok-tampon felhasználható a fertőző mononukleózis diagnosztizálására.

A vizsgálat előtt feltétlenül ellenőrizze orvosával, hogy pontosan mely anyagokat fogja használni az elemzéshez.

A PCR eredmények értelmezése és értelmezése

A következő PCR-elemzési eredmények lehetséges:

A negatív eredmény azt jelenti, hogy a vizsgálat tárgyát képező biológiai anyagban nem találtak fertőzés nyomait. A legtöbb esetben negatív eredmény A PCR-elemzés azt mutatja, hogy az emberi testben nincs olyan fertőzés, amelynek nyomát vizsgálattal próbálták kimutatni.

A pozitív eredmény azt jelenti, hogy a vizsgálat tárgyát képező biológiai anyagban fertőzés nyomait fedezték fel. A nagy pontosságú pozitív PCR-eredmény egy adott fertőzés jelenlétét jelzi.

Mennyire pontos a PCR a fertőzések diagnosztizálására?

A PCR módszer nagyon pontos, specifikus és érzékeny. Ez azt jelenti ezt az elemzést képes:

1. pontosan meg kell határozni a fertőzés jelenlétét vagy hiányát;
2. pontosan adja meg, milyen fertőzés (specifitás);
3. a fertőzést még a vizsgált biológiai anyag mikrobák nagyon alacsony DNS-tartalmával is kimutatható (érzékenység).

Az enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA) és a fertőzés diagnosztizálására szolgáló más immunológiai módszerekkel ellentétben a PCR sokkal kevésbé valószínűleg hamis negatív eredményeket eredményez (az elemzés azt mutatja, hogy a fertőzés nem létezik, miközben valójában van), és szinte soha nem ad hamis pozitív eredményeket (az elemzés azt mutatja a fertőzés jelenléte, míg valójában nem).

A PCR, vagy másként a polimeráz láncreakció különféle fertőző betegségek laboratóriumi diagnosztizálásának módszere.

Ezt a módszert Carey Mullis 1983-ban fejlesztette ki. A PCR-t kezdetben csak tudományos célokra használták, de egy idő után bevezették a gyakorlati orvoslás területére.

A módszer lényege a fertőzés okozójának azonosítása a DNS és RNS fragmensekben. Minden kórokozónak megvan a saját referencia-DNS-fragmentuma, amely nagyszámú másolat létrehozását váltja ki. Összehasonlítottuk egy meglévő adatbázissal, amely a DNS szerkezetére vonatkozó információkat tartalmazza. különböző típusok mikroorganizmusokat.

A polimeráz láncreakcióval nemcsak a fertőzést azonosíthatja, hanem kvantitatív értékelést is adhat neki.

Mikor használják a PCR-diagnosztikát?

Elemzés biológiai anyagA PCR alkalmazásával különféle urogenitális fertőzéseket lehet észlelni, ideértve a rejtett tüneteket is, amelyek nem jelentkeznek különleges tünetekkel.

Ez a kutatási módszer lehetővé teszi az alábbi személyek azonosítását:

• mindkét típusú herpes simplex vírus;
• HIV-fertőzés
• chlamydia
• ureaplasmosis;
• candidiasis;
• mycoplasmosis;
• trichomoniasis;
• valamint hepatitis B és C, tuberkulózis, helikobacteriosis, fertőző mononukleózis.

A terhesség előtti és alatti nőknek szükség esetén PCR-t írnak elő a különféle nemi fertőzések diagnosztizálására.

Biológiai anyag a PCR vizsgálatokhoz

A fertőzések PCR-rel történő kimutatására az alábbiak használhatók:

• vizelet, kenet a nyaki csatornából (nőkben), kenet a húgycsőből, ürítés a nemi szervekből - nemi fertőzések vizsgálatára;
• vér - HIV-fertőzés és hepatitis C vizsgálatára;
• torok-tampon - fertőző mononukleózis vizsgálatára.

A fertőzések PCR-diagnosztizálásának előnyei és hátrányai

A fertőzéses PCR-tesztek előnyei a következők:

1. Univerzálisság - ha más diagnosztikai módszerek tehetetlenek, a PCR kimutat minden RNS-t és DNS-t.
2. Sajátosságai. Az ezt a módszert alkalmazó vizsgálati anyagban kimutatják az adott patogénre jellemző nukleotidszekvenciát. A polimeráz láncreakció lehetővé teszi számos különböző patogén azonosítását ugyanabban az anyagban.
3. Érzékenység. Ezzel a módszerrel fertőzést észlelnek akkor is, ha annak tartalma nagyon kicsi.
4. Hatékonyság Nagyon kevés időbe telik a fertőzés kórokozójának azonosítása - csak néhány óra.
5. Ezenkívül a polimeráz láncreakció nem az emberi test reakcióját a kórokozó mikroorganizmusok behatolására, hanem egy specifikus kórokozó kimutatására segíti elő. Ennek köszönhetően betegség kimutatható egy betegben, még mielőtt konkrét tünetekkel megnyilvánulna.

Ennek "mínuszáig" diagnosztikai módszer magában foglalja a laboratóriumi helyiségek szűrőkkel való felszerelésének követelményeinek szigorú betartásának szükségességét magas fokozat tisztítás oly módon, hogy az elemzésre vett biológiai anyag ne szennyeződjön más élő szervezetek DNS-fragmenseivel.

A PCR-rel végzett elemzés néha negatív eredményt adhat egy adott betegség nyilvánvaló tüneteinek jelenlétében. Ez utalhat a biológiai anyag gyűjtésére vonatkozó szabályok be nem tartására.

Ugyanabban az időben pozitív eredmény az elemzés nem mindig bizonyítja, hogy a betegnek van egy meghatározott betegsége. Tehát például a kezelés után egy bizonyos ideig a már elpusztult kórokozó pozitív eredményt ad a PCR elemzésről.