PCR - polimerāzes ķēdes reakcija   - Tā ir mūsdienīga augstas precizitātes diagnostikas metode, kuras pamatā ir molekulārās bioloģijas sasniegumi un kas ļauj noteikt visa spektra slimību patogēnus, vairākkārt dubultojot atsevišķas DNS sadaļas fermentu ietekmē mākslīgi radītos apstākļos (in vitro).

Rezultātā tiek kopētas tikai tās sadaļas, kas atbilst noteiktajām prasībām, un tikai tajos gadījumos, kad tās ir pieejamas analizētajā paraugā. Lai identificētu slimības avotu, pietiek ar to, ka paraugā ir vismaz vairākas šī patogēna DNS molekulas.

Visbiežāk PCR izmanto, lai diagnosticētu dzimumorgānu un uroloģiskās slimības. Standarta pētījumu komplekts par pieņemamu cenu parasti ietver testu norīkošanu, lai identificētu 12 patoloģiju izraisītājus.

Kā tiek veikta PCR?

PCR analīze atklāj daudzu slimību baktērijas. Medicīnas klīnikās pētījumu kompleksā parasti ietilpst šādu baktēriju avotu identificēšana:

• hlamīdijas
• b un C hepatīts;
• mikoplazmoze;
• ureaplazmoze;
• gardnerelioze (baktēriju vaginosis);
• piena sēnīte (kandidoze);
• infekciozā mononukleoze;
• trihomoniāze;
• HPV (cilvēka papilomas vīruss);
• tuberkuloze
• herpes vīruss;
• HIV (AIDS).

Pirms sagatavošanās manipulācijām ir jāievēro daži ierobežojumi. Jums vajadzētu atteikties no seksa dienu pirms paredzētās procedūras datuma, neveiciet dušu un nepiesakieties zāles   (antibiotikas, pretiekaisuma līdzekļi utt.). Rīta priekšvakarā jūs nevarat ieturēt brokastis un dzert dzērienus. Vīriešiem vajadzētu atturēties no urinēšanas 2 stundas pirms izmeklējuma. Veicot urīnizvadkanāla gļotādas epitēlija šūnu nokasīšanu (vīriešiem) vai dzemdes kakla kanāls   dzemdes kakla (sievietēm). Materiālu paraugu ņemšanas procedūra tiek veikta sterilos apstākļos, izmantojot īpašas ierīces.

Iecelšanas indikācijas

• neparasta (pārāk bieza, bagātīga) izdalījumi no dzimumorgānu trakta;
• niezes, dedzināšanas un sāpju parādīšanās intīmo orgānu rajonā;
• kādu laiku pēc neaizsargāta seksuāla kontakta ar izlases partneri;
• lai uzraudzītu ārstēšanas efektivitāti;
• pirms uroģenitālās sistēmas orgānu ķirurģiskas ārstēšanas;
• noteikt neauglības vai aborta cēloni.

Ārstēšanas principi

PCR rezultātu 12 infekcijām var iegūt divas dienas pēc uztriepes ņemšanas analīzei. Plkst vesels cilvēks   iepriekš minēto slimību infekcijām organismā nevajadzētu būt.

Ja tiek atklāta kāda infekcija, ārstēšanu vajadzētu nozīmēt tikai ārsts, kurš izrakstīja nosūtījumu izmeklēšanai. Medicīnisko ieteikumu ieviešanas procesā ir stingri jāievēro visi punkti un noteiktā laikā jālieto zāles nepieciešamajās devās. Pretējā gadījumā ir iespējama slimības pāreja hroniskā formā vai nopietnu komplikāciju parādīšanās.

Kontrindikācijas

Praktiski nav tādu faktoru, kuru dēļ 12 infekciju PCR analīzi varētu aizliegt. Manipulāciju var atlikt uz ērtāku laiku tikai tad, ja pacients jūtas slikti vai viņam ir citas slimības (piemēram, gripa) akūtā formā.

PCR 12, kura cena ir diezgan saprātīga, ļauj savlaicīgi noteikt bīstamu kaites izraisītājus un izvairīties no tādu komplikāciju rašanās, kurām nepieciešama dārgāka ārstēšana.

Pakalpojumi virzienā " Mūsdienīga diagnostika"

Klīnikas "Mūsdienīgas diagnostikas" virzienā

  »STS un polimerāzes ķēdes reakcijas laboratoriskā diagnostika (lekcija)

STS un polimerāzes ķēdes reakcijas laboratoriskā diagnostika (lekcija)

ph.D. Pokrovskaya M.S.
  Corr. RAMS, prof. Smirnovs G.B.
  (NIIEM viņiem. NF Gamalei RAMS un AS "LAGIS")

Ievads

Jau sen ir zināms, ka, lai izārstētu pacientu, jums jāzina, ar ko tieši viņš slimo. Slimības veida noteikšanas procesu sauc par diagnozi. Jebkuras slimības diagnozi veic ārsts (pamatojoties uz anamnēzes pētījumu, klīnisko izpausmju novērošanu un datu analīzi) laboratorijas pētījumi), pēc kura viņš izraksta ārstēšanu. Mūsdienās ārsts, veicot diagnozi, izmanto laboratorisko izmeklējumu datus, bez kuriem ir vai nu grūti noteikt pareizu diagnozi, vai dažos gadījumos tas vispār nav iespējams.

Diagnozes kā slimību atpazīšanas procesa nozīme ir tā, ka savlaicīga, precīza diagnoze ir racionālas un efektīvas terapijas pamats, un vairumā gadījumu tā ļauj paredzēt iespējamās slimības turpmākās gaitas un iznākuma iespējas.

Infekcijas slimību diagnozē, tai skaitā STS ir svarīgi, lai identificētu etioloģisko faktoru (patogēnu) un noteiktu slimības stadiju, tas ir, iegūtu informāciju, kas nepieciešama etiotropiskas un adekvātas terapijas izvēlei, lai prognozētu slimības gaitu un tās pabeigšanas laiku.

Raksturīgās iezīmes mūsdienu laboratoriskā diagnostika   ir pastāvīga jaunu izstrāde un zināmo metožu un paņēmienu pilnveidošana. Tas ir saistīts ar faktu, ka pēdējās desmitgadēs   nepārtraukti mainās gan infekcijas slimību klīniskā aina, gan to patoģenēzes raksturojums. Piemēram, labi zināmi diezgan bīstami patogēni var izraisīt izdzēstas slimību formas vai otrādi: nosacīti patogēni vai uzskatīti par patogēniem mikroorganismiem izraisa smagas formas. Patogēno mikroorganismu tropisms mainās (tiek ietekmēti citi orgāni un audi), un rezultātā parādās jauni infekcijas procesu veidi. Pastāv hroniskas, pastāvīgas infekcijas formas un mainās patogēnu antigēnā struktūra, mikroorganismi pārvēršas par neaudzētu stāvokli. Atkāpes no klasiskajām infekcijas slimību gaitas formām un netipisko formu rašanās ir saistītas ar diviem apstākļiem. Pirmkārt, imūnās sistēmas stāvoklis ir mainījies daļā iedzīvotāju, imūndeficīta stāvokļi ir kļuvuši izplatīti dažāda rakstura. Otrkārt, mainās paši patogēni. Tas ir, mēs esam liecinieki evolūcijas procesam mikroorganismos.

Tas viss sarežģī diagnozi un nelabvēlīgi ietekmē ārstēšanas efektivitāti. Lietošanas loma mūsdienu metodes   laboratorijas pētījumi diagnozes noteikšanai šobrīd kļūst ļoti nozīmīgi.

Infekcijas slimību diagnosticēšanai tiek izmantotas dažādas laboratorijas un instrumentālās metodes, starp kurām noteikto vietu ieņem īpašas metodes, kuru mērķis ir identificēt slimības izraisītāju un tādējādi noteikt etioloģisko diagnozi.

Šī ziņojuma temats ir atlasītas infekcijas slimību laboratoriskās diagnostikas sadaļas.

Infekciju laboratoriskās diagnostikas pamatjēdzieni un metodes

Galvenie laboratoriskās diagnostikas rādītāji ir infekciju patogēnu (sēnīšu, vienšūņu, baktēriju un vīrusu) identificēšanas metožu jutīgums un specifiskums.

• Jutīgums- tas ir minimālais materiāla daudzums, ko var noteikt ar šo metodi. Materiāls var būt veseli mikroorganismi un patogēna molekulu fragmenti, kā arī specifiskas antivielas, kuras cilvēka ķermenis ražo, reaģējot uz infekciju. Jo mazāk materiālu var noteikt, jo augstāka ir tā jutība. Ja laboratorijas testā netiek atklāti mikroorganismi, kas atrodas paraugā un kuru noteikšanai ir izstrādāta testa sistēma, rezultātu sauc par viltus negatīvu. Jo augstāka ir metodes jutība, jo mazāk kļūdaini negatīvu [nepatiesu (-)] rezultātu.
• Specifiskums- tā ir metodes spēja norādīt, ka paraugā ir tikai tas objekts, kura noteikšanai ir izstrādāta testa sistēma. Ja metode norāda mikroorganismu klātbūtni paraugā, kas tajos nav, rezultātu sauc par kļūdaini pozitīvu. Jo augstāka ir metodes specifika, jo mazāk kļūdaini pozitīvu [viltus (+)] rezultātu.

  Visas laboratoriskās diagnostikas metodes var iedalīt divās grupās: tiešas un netiešas mikroorganismu noteikšanas metodes.

• Tiešās metodestā nosaukts tāpēc, ka tie tieši identificē infekcijas izraisītājus vai materiālu, kas ir daļa no patogēna vai ko tas ir ražojis. Parasti tie ir antigēni vai ģenētiskais materiāls. Tiešās metodes ietver šādas (1. tabula):

  1. tabula. Tiešās laboratoriskās diagnostikas metodes
  Metodes	Metodes princips	Specifiskums	Jutīgums
  Mikrobioloģiskā	Patogēna tīras kultūras izolēšana	100% zelta standarta laboratorijas diagnostika	1000-10 000 šūnas / ml
  Citoloģiskā (mikroskopija)	Traipu uztriepes pārbaude	20-80%	1000–100 000 šūnu / ml
  Imunocitoloģiskā un seroloģiskā	Antigēnu identificēšana pēc saistīšanās ar antivielām RIF, ELISA	70-90%	1000–100 000 šūnu / ml
  Molekulāri bioloģiskā	Specifiska DNS / RNS reģiona noteikšana patogēna genomā	99–100% atbilst “zelta standartam”	200 šūnas / ml (1 šūna vienā reakcijā)

  Nepatiesi (+) rezultāti citoloģiskās metodes gadījumā ir saistīti ar rezultātu novērtēšanas subjektivitāti, imunoloģisko metožu gadījumā - ar antigēnu savstarpēju reakciju ar antivielām.

  Kļūdaini (-) tiešo metožu rezultāti var būt saistīti ar patogēna nepieejamību klīniskā materiāla savākšanas laikā, mikrobioloģiskajai metodei - mikroorganisma nāvei parauga pārvadāšanas laikā un neaudzētas formas gadījumā.

• Netiešās metodestā nosaukts tāpēc, ka materiālu atklāj nevis pats patogēns, bet gan specifiskas antivielas, kuras izstrādājusi persona, reaģējot uz šāda veida infekciju, t.i. ir imunoloģiski. Pie šādām metodēm pieder: komplimentu saistoša reakcija (CSC), netieša imunofluorescences reakcija (RNIF), mikroimmunofluorescences reakcija (MIF), rekombinantā lipopolisaharīda ELISA (r - ELISA), enzīmu imūnanalīze (ELISA). Šo metožu jutība ir 1000–100000 šūnas / ml.

  Ja gandrīz visos gadījumos izmanto imunoloģiskās metodes, viltus (+) rezultāti ir saistīti ar antivielu nespecifisku saistīšanos ar antigēniem vai antigēnu savstarpēju reakciju ar antivielām. Kļūdaini (-) rezultāti rodas nepietiekama specifisko antivielu vai antigēnu skaita dēļ paraugā un nepietiekamas noteikšanas metožu jutības dēļ.

  Neskatoties uz ievērojamajiem mūsdienu panākumiem laboratoriskā diagnostika   praksē neviena metode negarantē 100% jutības un specifiskuma apvienojumu. Tas nozīmē, ka tā nesniedz 100% pareizu atbildi. Tāpēc, lai veiktu diagnozi, ārstam bieži jāizmanto vismaz divas dažādas metodes, un katru pētījumu vislabāk veikt divos vai trīs atkārtojumos. Šī prasība ir diagnosticējama tādām slimībām kā tuberkuloze, hlamīdija un dažas citas (1).

Diagnostiskā vērtība A, M, G klases imūnglobulīnu noteikšanai

Ļaujiet mums sīkāk pakavēties pie seroloģiskās diagnostikas (antivielu noteikšana asins serumā ar ELISA metodi). Tas ir balstīts uz ļoti specifisku antivielu (antivielu) noteikšanu, kas veidojas cilvēka ķermenī, reaģējot uz mikroorganismu klātbūtni - infekciju patogēniem. Šīs antivielas ir M, A, G. klases imūnglobulīni (Ig). Antivielas neitralizē infekcijas izraisītājus, mijiedarbojoties ar antigēniem. Antigēns ir specifiska infekcijas izraisītāja (mikroorganisma) daļa, kas izraisa specifisku antivielu veidošanos cilvēka ķermenī (imūnreakcija). Seroloģisko reakciju pamatā ir antigēna un antivielas specifiskā mijiedarbība. Apsveriet, ko atklāj diagnoze IgM, IgA, IgG klašu antivielu noteikšanai (2. tabula).

2. tabula. Infekcijas slimības stadijas noteikšana saskaņā ar antivielu pētījuma rezultātiem asins serumā ar ELISA metodi
Slimības stadija (forma)	Antivielas parādīšanās secībā asins serumā	Nosaukuma dinamika (2-3 nedēļu laikā)
Akūta primārā infekcija	IgM ⇒ IgG ⇒ IgA vai - IgM ⇒ IgA ⇒ IgG ⇒    agri vai agri IgG	Titru palielināšanās vai samazināšanās (IgM pēc 7. dienas) atkarībā no laika, kas pagājis kopš infekcijas sākuma
Sekundārā infekcija un reaktivācija (recidīvs)	IgG ⇒ IgA, IgM gandrīz pilnībā nav    ⇒ agri vai agri IgG	Strauja titru palielināšanās vai samazināšanās
Hroniska	IgG ⇒ IgA,    dažreiz tikai IgA    vai tikai IgG	Pastāvīgi zemi titri var būt pastāvīgi augsti - smagas augšupejošas infekcijas vai sistēmisku bojājumu gadījumā.
Noturība, pārvadāšana	IgA vai IgG	Pastāvīgi (vairākas nedēļas) zemi titri (antivielas ne vienmēr tiek noteiktas mainītās mikroorganismu antigēnās struktūras dēļ)
Ilgstoša slimība	IgG	Konsekventi zemi titri

Dažādu klašu antivielu kvantitatīvā noteikšana palīdz noteikt slimības gaitas stadiju un raksturu. Interpretējot kvantitatīvos rezultātus, ir jāņem vērā, ka imūnā atbilde cilvēka ķermenis   infekcijas attīstība un tās radīto antivielu līmenis ir atkarīgs no patogēnu īpašībām, infekcijas procesa stadijas un imūnsistēmas individuālajām īpašībām. Smagas imūnsupresijas gadījumā AT sintēzi var pilnībā nomākt. Tāpēc, lai veiktu diagnozi, īpaši ar netipiskām infekcijas formām, ārsts nevar viennozīmīgi interpretēt viena pētījuma kvantitatīvo rezultātu.

Lai pareizi novērtētu dažādu infekcijas izraisītāju antivielu kvantitatīvās noteikšanas rezultātus, ir jāizmanto pāra seruma princips (atkārtojiet pētījumu pēc 2-3 nedēļām un salīdziniet rezultātus). Šādi pētījumi dod iespēju analizēt antivielu noteikšanas dinamiku un tādējādi iegūt nepieciešamā informācija   par infekcijas procesa attīstību. Četrkārtīgs antivielu pieaugums 2-3 nedēļu laikā norāda uz infekcijas attīstību.

ELISA kvantitatīvie rezultāti ir nepieciešami tieši tāpēc, lai varētu veikt šādus pāra pētījumus.

Tradicionālais veids, kā noteikt akūtu infekciju, ir IgM noteikšana serumā. Mūsdienu diagnostikas pārbaudes sistēmas ļauj papildus IgM atklāt arī citas agrīnas antivielas, piemēram: 1) IgG pret agrīniem vīrusu vīrusiem un 2) zemas aviditātes IgG. Turklāt IgG pret vīrusu agrīnajiem proteīniem ir gan primāras akūtas infekcijas, gan recidīva (hroniskas infekcijas saasināšanās) un reinfekcijas, t.i. visi akūtas infekcijas varianti, atšķirībā no IgM, tiek ražoti, kā likums, tikai ar primāro infekciju.

Polimerāzes ķēdes reakcija

Ievads molekulārās diagnostikas metožu medicīniskās mikrobioloģijas praksē, protams, bija nozīmīgs notikums, jo tas radikāli paplašināja iespēju izpētīt slimību patoģenēzi, būtiski uzlaboja diagnozi un pat ieskicēja jaunas ārstēšanas metodes. Aizvien izplatītāka ir uz PCR balstīta molekulārās diagnostikas metode, kas dod optimālu augstas jutības un specifiskuma kombināciju.

Molekulārā diagnostika kopumā un jo īpaši PCR balstās uz noteiktu nukleīnskābju, visbiežāk DNS, klātbūtnes noteikšanu testa paraugā.

DNS ir divpavedienu (divpavedienu) polimēra molekula, kuras nukleotīdu secība nosaka visas ķermeņa īpašības. Šūnu dalīšanā DNS dubultojas, un mātes šūnas ģenētiskā materiāla precīza kopija nonāk katrā no abām meitas šūnām. DNS molekulas dubultošanu sauc par replikāciju. Uz divām sākotnējām (matricas) DNS ķēdēm tiek būvētas jaunas meitas ķēdes (papildinošas matricai). Replikāciju nodrošina fermentatīvs komplekss, kura galvenais elements ir DNS polimerāze. Lai DNS polimerāze sāktu tai replicēties, papildus matricai ir nepieciešams arī sēklas materiāls (gruntējums) - neliels DNS fragments, kas papildina matricu. Šī sēklu DNS polimerāze it kā pagarinās, uz esošās matricas veidojot jaunu DNS virkni. Parasti visa šūna vai vīruss DNS atkārtojas dabā, un šī procesa rezultāts ir divas identiskas oriģinālās DNS kopijas.

Tagad, kad mēs esam īsi atgādinājuši vissvarīgāko par replikāciju, mēs varam pāriet uz polimerāzes ķēdes reakcijas aprakstu. PCR tika atvērta 1983. gadā, un tagad to plaši izmanto zinātniskos un praktiskos pētījumos infekcijas un ģenētisko slimību diagnostikā, dažu onkoloģisko patoloģiju agrīnā diagnosticēšanā. Par šīs metodes atklāšanu Kerijam Mullisam 1995. gadā tika piešķirta prestižākā zinātniskā balva - Nobela prēmija.

Šīs reakcijas laikā tiek replicēts arī DNS, bet ne kā parasti dabā. Pirmkārt, replicējas ne visa mikroorganisma DNS, bet tikai tā mazais fragments (mērķis).

Otrkārt, PCR produkts nav divi, bet miljoniem oriģinālā mērķa eksemplāru. Šo atkārtoto replikāciju sauc par pastiprināšanu.

Plkst dažādi veidi un baktēriju sugas, kā arī vīrusi, ģenētiskie teksti (DNS nukleotīdu secības) atšķiras. Mūsdienu datorprogrammās ir dažādu organismu atšifrētu DNS sekvenču datu bāze. Izstrādājot diagnostisko PCR testa sistēmu, tiek atrasts neliels DNS fragments (mērķis), kas ir stingri specifisks konkrētam patogēnam. Izmantojot PCR, šo reģionu pastiprina, un pēc tam amplifikācijas produktu (amplikonu) identificē ar agarozes gēla elektroforēzi.

Identificējot konkrēta mikroorganisma DNS fragmentu, tādējādi tiek noteikts mikroorganisms.

Katrs infekcijas diagnozes cikls norisinās trīs posmos (att.):

1. Denaturācija - divpavedienu DNS ķēžu aušana - nav fermentatīvs process, kas notiek 95 ° C temperatūrā.
2. Gruntējumu pievienošana (atlaidināšana). Lai sāktu replikācijas procesu PĶR, tiek izmantoti grunti - īsas vienpavedienu DNS (15-30 bāzes garas), kuras pārmērīgi pievieno reakcijas maisījumam. Tie īpaši (saskaņā ar komplementārā pārī izveidošanas principu) ir piestiprināti īsām sekcijām, kas saista izvēlēto mērķi. Šis posms nav fermentatīvs un notiek reakcijas maisījuma inkubācijas laikā 55–65 0 С temperatūrā. Gruntskrāsas piestiprinās tikai atlasītajiem DNS fragmentiem, kas raksturīgi šim patogēnam, un nav mijiedarbojas ar citām DNS sekvencēm (un klīniskajā paraugā ir daudz DNS, piemēram, cilvēka un dažādi mikroorganismi). Tas nodrošina diagnostiskās PCR pārbaudes sistēmas absolūto specifiskumu. Pārmērīgi daudz DNS praimeru attiecībā uz matricas DNS nodrošina augstu metodes jutīgumu. Tas ir, sākotnējā PCR šķīdumā primeriem ir 100% ticamība atrast piesaistīšanas mērķi.
3. Gruntējumu pievienošanas rezultātā veidojas struktūras [DNS matrica + grunts], kas ir “sēklu” kompleksi. Gruntēšana tiek pabeigta, sākot no 3 beigām, ar vienpavedienu DNS fragmentu papildinošu sintēzi uz matricām. Šo procesu veic, izmantojot īpašu enzīmu - Taq polimerāzi (karstumizturīgu DNS polimerāzi) un nukleotīdus (kā celtniecības materiālu).

   Nesen sintezētā divpavedienu DNS pēc denaturēšanas posma atkal saista gruntskrāsas, kuru maisījumā ir vairāk. Iegūtās struktūras pēc pabeigšanas veido specifiskus DNS fragmentus, ko ierobežo gruntēšanas secības. Tādējādi, pat ja PCR sākumpunkts bija tikai viena DNS molekula, amplifikācija notiek 25–40 ciklu laikā, t.i. ir sintezēts liels skaits   (108-109 kopijas) īpašu DNS fragmentu (amplikonu), kas ir pietiekami, lai vizuāli reģistrētu reakcijas rezultātu pēc agarozes gela elektroforēzes.

PCR veic ciklatorā vai termociklers   - ierīce, kurā cikliski automātiski tiek veikts iepriekš noteikts temperatūras maiņas režīms, ļaujot vairākiem posmiem atkārtoti iziet 1, 2, 3.

Reakciju veic, izmantojot agarozes gela elektroforēzi. Negatīvi uzlādētas DNS molekulas elektriskā lauka ietekmē pārvietojas želejā no katoda uz anodu, savukārt DNS fragmentu vidējais brīvais ceļš noteiktā laika posmā ir atkarīgs no to lieluma. Želejā esošās DNS iekrāso ar etiīdija bromīdu, kas padara to redzamu ultravioletā gaismā. Ja PCR rezultātā testa paraugā uzkrājas amplikoni (tāda paša izmēra DNS fragmenti), tad tie atradīsies tādā pašā attālumā no sākuma un būs redzami kā sloksne uz gēla ceļa. Ja sloksnes novietojums uz gēla sliežu ceļa atbilst aprēķinātajam izmantotajam gruntējumu pārim, t.i. ir tādā pašā attālumā no sākuma kā pozitīvās kontroles sloksne, tas nozīmē, ka pētījuma rezultāts ir pozitīvs.

Tāpat kā katrā eksperimentā, ņemot vērā PCR rezultātus, tiek nodrošināta kontrole - pozitīva un negatīva. Jebkurai diagnostikas pārbaudes sistēmai jābūt apstiprinātiem noteikumiem, kas ietver minēto vadības ierīču klātbūtni.

Pozitīva kontrole ir paraugs ar DNS šablonu specifiska amplikona uzkrāšanai, kas atbilst identificētajam mikroorganismam.

Negatīva kontrole ir ūdens, cilvēka DNS vai mikroorganismu DNS, kas ir cieši saistīti ar noteikto testa sistēmu.

PCR metodes priekšrocības

PCR diagnostika ir viena no modernākajām un modernākajām laboratorijas diagnostikas metodēm, kas ļauj specifiski noteikt infekcijas slimības patogēnu atsevišķu šūnu DNS.

Starp molekulārās diagnostikas metodēm, ieskaitot PCR, ir būtiska atšķirība no visām citām tradicionālajām metodēm. Šī atšķirība ir tāda, ka tradicionālās metodes atklāj mikroorganismu gēnu aktivitātes produktus (olbaltumvielas, antigēnus un sarežģītākas organizētās pazīmes), bet PCR tieši atklāj ģenētisko materiālu. Tādējādi mikroorganismu nosaka ar PCR, neatkarīgi no genoma funkcionēšanas iezīmēm, netipiskām izpausmēm.

Mēs varam teikt, ka PCR sasniedz maksimālo iespējamo jutīgumu. PCR testa sistēmu jutība ir 10-1000 šūnas paraugā, savukārt imunoloģisko un mikroskopisko metožu jutība ir 1000-100000 šūnas paraugā. Sakarā ar augsto jutīgumu, uz PCR balstītas pārbaudes sistēmas ir neaizstājamas gadījumos, kad pētāmais materiāls (patogēns) ir ļoti mazs.

Sakarā ar augsto jutīgumu, PCR pārbaude ļauj agrīna diagnostika   slimības (piemēram, kārtējie izmeklējumi   populācija), lai precizētu diagnozi uz antibiotiku terapijas fona, pārbaudītu izārstēšanu (ārstēšanas efektivitāti), kā arī noteiktu noturīgus mikroorganismus. Dažiem patogēniem, piemēram, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, PCR diagnostisko testu sistēmu jutībai nevajadzētu būt lielai. Jutīguma indikatori ir īpaši izstrādāti un apstiprināti, sākot ar 105–6 šūnām ml. Šādas pārbaudes sistēmas atklāj diagnostiski nozīmīgu daudzumu šo mikroorganismu (2,3).

Identificējot patogēno mikroorganismu grūti kultivētas, nekultivētas un noturīgas formas, nepieciešamo diagnostisko atbildi nodrošina tikai tieša metode, ar kuras palīdzību nosaka patogēna DNS. Citas diagnostikas metodes (imunoloģiskas, bakterioloģiskas, mikroskopiskas) ir sarežģītas vai pat neiespējamas. Noturīgu mikroorganismu gadījumā tas var būt saistīts ar izmaiņām patogēnu antigēniskajā struktūrā vai ar šādu mikroorganismu pāreju nekultivētā formā. Tas ir jāatceras, diagnosticējot latentas un hroniskas infekcijas.

PCR metodes augsto specifiskumu nosaka praimeru nukleotīdu secība un nosacījumi to piestiprināšanai pie īpaša patogēna specifiska DNS fragmenta (mērķa), kas tika īpaši izstrādāts, veidojot PCR testa sistēmu. Atkarībā no izvēlētajiem gruntiem PCR testa sistēma var diferencēt vienas sugas mikroorganismu ģintis, sugas, serotipus un pat patogēnos un nepatogēnos celmus.

Izmantojot PCR infekciju diagnosticēšanai, ir iespējams noteikt patogēnu jutīgumu (vai rezistenci) pret daudzām izmantotajām antibiotikām. Īpaši tas attiecas uz gadījumiem, kad mikrobioloģisko pētījumu metodi nav iespējams pielietot.

PCR analīzei ir piemērots jebkurš klīniskais materiāls, kas potenciāli satur infekcijas izraisītājus - asinis, serums, skalošanas šķidrums, krēpas, siekalas, kuņģa sula, biopsijas materiāls, uztriepes, tamponi. Pētītais materiāls var būt priekšmetu paraugi ārējā vide   (mazgāšana, pirkstu nospiedumi, uztriepes, ūdens, augsne utt.).

PCR ir vienota un automatizēta metode, kas ļauj standartizēti ievērot noteikumus, kas apstiprināti šīs PCR testa sistēmas izmantošanas atļaujās, un nodrošina augstu rezultātu precizitāti un reproducējamību.

PCR laboratorijas diagnostika - ātra un uzticams veids   infekcijas slimību patogēnu identificēšana. PĶR laboratorija sniedz atbildi pēc 48 stundām no dienas, kad materiāls piegādāts pētījumam. (Katra parauga neto pētījumu laiks ir tikai dažas stundas.)

Vienā klīniskajā paraugā vienlaikus var noteikt vairāk nekā 20 patogēnu klātbūtni.

Svarīgs aspekts, veicot klīniskā parauga pētījumu, ir atbilstība klīniskā materiāla vākšanas un glabāšanas noteikumi. Šeit ir tikai daži vispārīgi ieteikumi:

• Klīniskais materiāls tiek ņemts no paredzētā mikroorganismu dzīvotnes un infekcijas attīstības (šim nolūkam ir jāņem vērā ieejas vārti, izplatības ceļi, vairošanās vietas un ceļi vēlamo mikroorganismu izolēšanai).
• Izmešanas daudzumam savāktajā materiālā jābūt mazam (ne vairāk kā “ar spēles galvu”). Pārmērīga izdalīšanās, gļotas un strutas negatīvi ietekmē DNS ieguves kvalitāti un veicina DNS sadalīšanos uzglabāšanas un transportēšanas laikā.
• Klīniskā materiāla savākšanai izmantojiet tikai vienreizējās sukas vai tamponus. Ievadot klīnisko materiālu laboratorijas mēģenē ar šķīdumu, ievērojiet sterilitāti.

Molekulārās diagnostikas nozīme

Viens no visvairāk pārsteidzoši piemēri, kas parāda molekulārās diagnostikas nozīmi, ir cilvēka papilomas vīrusu infekcijas ar augstu onkogēno risku noteikšana. Ne visi papilomas vīrusi izraisa ļaundabīgu augšanu. Atšķirt vīrusu genotipus, kas ar lielu varbūtību izraisa vēzi, un tā sauktos labdabīgos genotipus. Pie pirmajiem pieder 16., 18. (mūsu reģionā izplatīti) genotipi, 26., 31., 33., 35., 39., 45., 51., 52., 55., 56., 58., 59., 68 (ME180), MM4 (W13B), MM7 ( P291) un MM9 (P238A). Labdabīgi genotipi ietver 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66 un MM8 (P155). Papilomas vīrusa genotipa identificēšana ir iespējama, un to veic, izmantojot PCR (4,5).

Šūnās saglabājas papilomas vīrusa tipi 16.18 plakanšepitēlijs   dzemdes kakla, neizraisot klīniskas izpausmes gadiem ilgi (līdz 5 gadiem, inkubācijas periods), līdz brīdim, kad veidojas pamanāmas jaunveidojumi. Agrīna diagnostika šādos gadījumos ir iespējama tikai ar profilaktiskās apskates   populācija, kas izmanto PCR. Papilomu vīrusu tipu DNS noteikšanas gadījumā, kas izraisa vēzi ar lielu varbūtību, pacientam jākonsultējas ar onkologu, jāapmeklē viņu reizi mēnesī, jāuzrauga klīniskās izpausmes. Tādējādi PCR šajā gadījumā ļauj veikt agrīnu diagnostiku, kas palīdz novērst vai neuzsākt dzemdes kakla vēzi.

Vairākos gadījumos noteiktos slimības posmos patogēnus nevar atšķirt ar klasiskām mikrobioloģiskām metodēm. Tas ir saistīts ar faktu, ka mikroorganismi var atrasties epitēlija šūnās, audos vai gļotās (piemēram, hlamīdijām, mikoplazmām, ureaplazmām, visiem vīrusiem ir raksturīga intracelulāra lokalizācija, un trihomonādi un gonokoki var būt gan starpšūnu, gan ārpusšūnu). Turklāt dažas baktērijas noteiktu faktoru ietekmē var pāriet tā sauktajās neaudzētajās formās vai nekulturālā stāvoklī. Kā piemēru var minēt hlamīdiju medicīnisko izpēti. Chlamydia trachomatis noteikšanas ilgums infekcijas vietā tika salīdzināts, izmantojot audu kultūras metodes, tiešo fluorescenci, PCR (DNS noteikšana) un Western blot (RNS noteikšana). Tika konstatēts, ka nukleīnskābju noteikšanas metodes patogēnu uzliesmojumā atklāj 4 nedēļas ilgāk (16 nedēļas pret 12 nedēļām pēc sākotnējās inficēšanās) nekā tradicionālās metodes. Šajā darbā tika izdarīts secinājums par hlamīdijas pārejas iespējamību infekcijas procesa laikā uz neaudzētu stāvokli. Šajā stāvoklī hlamīdijas turpina izraisīt iekaisumu vai saglabājas epitēlija šūnās, bet ar mikrobioloģisko metodi netiek atklātas (6).

Pašlaik ir uzkrāts ļoti daudz materiālu, kas norāda uz molekulārās diagnostikas nozīmīgumu, taču mēs nevaram izskatīt citus piemērus ierobežotās šīs publikācijas apjoma dēļ.

Stratēģija laboratorijas diagnostikas metožu izmantošanai

Ieslēgts mūsdienu skatuve   infekcijas slimību laboratoriskās diagnostikas izstrāde, acīmredzama nepieciešamība pēc integrētas pieejas, kas sastāv no dažādu laboratorijas metožu izmantošanas, lai noteiktu infekcijas slimības etioloģisko diagnozi. Pēc anamnēzes un klīnisko izpausmju izpētes ārsts izlemj par noteiktas laboratorijas pētījumu metodes izmantošanu. Tiek izmantotas dažādas metožu kombinācijas atkarībā no patogēnu bioloģijas īpašībām un to mijiedarbības ar cilvēka imūnsistēmu, kā arī no slimības formas.

Piemēram, hlamīdiju, herpes vīrusu, toksoplazmu laboratoriskai diagnostikai analizē PCR un ELISA pētījumu rezultātus. Un mikoplazmozes un ureaplazmozes laboratoriskajā diagnostikā izmanto PCR kombināciju ar kultūru izolēšanu ar jutības noteikšanu pret antibiotikām. Lai identificētu nespecifiski nosacīti patogēnu mikrofloru, tiek izmantota uztriepes mikroskopija un mikrobioloģiskā metode kultūru izolēšanai.

Ārsts veic diagnozi, pamatojoties uz pacienta anamnēzes, klīnisko izpausmju un laboratorijas diagnostikas datu izpēti.

Atsauces:

• Seksuāli transmisīvās infekcijas, Nr. 2, 2002.-21.-24.lpp. Uroģenitālā hlamīdiju infekcija. Pieejas diagnozei un terapijai. G.A. Dmitrijevs, Krievijas Federācijas TsNIKVI Veselības ministrija, Maskava.
• Mācību rokasgrāmata. Visu krievu izglītības-zinātniski-metodiskais centrs medicīnas un farmācijas tālākizglītībai. Maskava, 1999. Maksts mikroekoloģija. Mikrofloras korekcija maksts disbiozes gadījumā. V.M. Koršunovs, ... L.I. Kafarskaya, ... V.V. Smejanovs. Krievijas Federācijas Veselības ministrija, RSMU, MIMSR, RMAPO, Maskava.
• Seksuāli transmisīvās infekcijas, Nr. 1, 2002.-8-15. Lpp. Pašreizējais stāvoklis   Ureaplasma urealiticum nozīme uroģenitālo slimību ģenēzē. V.I. Kisina, O.S. Zagrebina, K.I. Zabirovs, V.V. Maisi. TSNIKVI Krievijas Federācijas Veselības ministrija, Maskavas Veselības ministrijas Pilsētas klīniskā slimnīca Nr. 47.
• Kanceroģenēze. Autoru kolēģis, kuru rediģēja D.G. Zaridze. Zinātniskā pasaule, 2000, Maskava. Papilomas vīrusi un to loma dzemdes kakla kanceroģenēzē. F.L. Kiseļevs. Vēža pētījumu centrs RAMS.
• Medicīniskā laboratoriskā diagnostika (programmas un algoritmi). Direktoriju rediģējis prof.A.I. Karpishchenko, 2001, Intermedika, Sanktpēterburga.
• Inficēt. Immun., 1992. gada maijs, 2040. – 2047., 60. sējums, Nr. 5. Hlamīdiju RNS un DNS demonstrēšana kultūrnegatīvā stāvoklī. SM Holande, ... HR Teilore. Infekcijas slimību nodaļa, Džona Hopkinsa slimnīca, Baltimora, Merilenda.

Bioloģiskai PCR var izmantot dažādus bioloģiskos materiālus, kas var saturēt mikrobus vai to fragmentus.

Lai identificētu dzimumorgānu infekcijas vīriešiem un sievietēm, analīzei, izdalījumiem no dzimumorgāniem, uztriepes no urīnizvadkanālsuztriepes no dzemdes kakla, kā arī urīns.

Lai diagnosticētu vīrusu C hepatītu un HIV infekciju, analīzei ņem asinis.

Lai diagnosticētu infekciozo mononukleozi, var izmantot rīkles tamponu.

Pirms pārbaudes noteikti noskaidrojiet ārstam, kādi materiāli tiks izmantoti analīzei.

PCR rezultātu interpretācija

Ir iespējami šādi PCR analīzes rezultāti:

Negatīvs rezultāts nozīmē, ka bioloģiskajā materiālā, kas tika pakļauts pētījumam, netika atrastas infekcijas pēdas. Vairumā gadījumu negatīvs rezultāts   PCR analīze norāda, ka cilvēka ķermenī nav infekcijas, kuras pēdas viņi mēģināja atklāt, veicot pārbaudi.

Pozitīvs rezultāts nozīmē, ka bioloģiskajā materiālā, kas tika pakļauts pētījumam, tika atklātas infekcijas pēdas. Pozitīvs PCR rezultāts ar augstu precizitātes pakāpi norāda uz noteiktas infekcijas klātbūtni.

Cik precīza ir PCR infekciju diagnosticēšanai?

PCR metode ir ļoti precīza, specifiska un jutīga. Tas nozīmē, ka šī analīze   spējīgs:

1. precīzi noteikt infekcijas esamību vai neesamību;
2. precīzi norādiet, kāda veida infekcija (specifika);
3. atklāt infekciju pat ar ļoti mazu mikrobu DNS saturu pārbaudītajā bioloģiskajā materiālā (jutība).

Atšķirībā no fermentiem piesaistītā imūnsorbenta testa (ELISA) un citām imunoloģiskām metodēm infekcijas diagnosticēšanai, PĶR daudz mazāk rada nepatiesus negatīvus rezultātus (analīze parāda infekcijas neesamību, kamēr tā patiesībā ir), un gandrīz nekad nesniedz kļūdaini pozitīvus rezultātus (analīze rāda infekcijas klātbūtne, kamēr tās patiesībā nav).

PCR jeb citādi polimerāzes ķēdes reakcija ir dažādu infekcijas slimību laboratoriskās diagnostikas metode.

Šo metodi Carey Mullis izstrādāja 1983. gadā. Sākumā PCR tika izmantots tikai zinātniskiem mērķiem, bet pēc kāda laika tas tika ieviests praktiskās medicīnas jomā.

Metodes būtība ir identificēt infekcijas izraisītāju DNS un RNS fragmentos. Katram patogēnam ir savs atsauces DNS fragments, kas izraisa liela skaita tā kopiju izveidošanu. To salīdzina ar esošo datu bāzi, kurā ir informācija par DNS struktūru. dažādi veidi   mikroorganismi.

Izmantojot polimerāzes ķēdes reakciju, jūs varat ne tikai identificēt infekciju, bet arī dot tai kvantitatīvu novērtējumu.

Kad tiek izmantota PCR diagnostika?

Bioloģiskā materiāla PCR analīze palīdz noteikt dažādas uroģenitālās infekcijas, arī latentās, kas neizpaužas ar īpašiem simptomiem.

Šī pētījumu metode ļauj identificēt šādas infekcijas cilvēkā:

• abu veidu herpes simplex vīruss;
• HIV infekcija
• hlamīdijas
• ureaplazmoze;
• kandidoze;
• mikoplazmoze;
• trihomoniāze;
• kā arī B un C hepatīts, tuberkuloze, helikobakterioze, infekciozā mononukleoze.

Gatavojoties grūtniecības laikā un grūtniecības laikā, sievietei obligāti tiek noteikts PCR dažādu dzimumorgānu infekciju diagnosticēšanai.

Bioloģiskais materiāls PCR pētījumiem

Infekcijas noteikšanai ar PCR palīdzību var izmantot šādus līdzekļus:

• urīns, uztriepes no dzemdes kakla kanāla (sievietēm), uztriepes no urīnizvadkanāla, izdalījumi no dzimumorgāniem - dzimumorgānu infekciju pārbaudei;
• asinis - HIV infekcijas un C hepatīta pārbaudei;
• rīkles tampons - infekciozās mononukleozes pārbaudei.

Infekciju PCR diagnostikas priekšrocības un trūkumi

Infekciju PCR testu priekšrocības ir šādas:

1. Universālums - ja citas diagnostikas metodes ir bezspēcīgas, PĶR nosaka jebkādas RNS un DNS.
2. Specifiskums. Pārbaudes materiālā, izmantojot šo metodi, tiek atklāta nukleotīdu secība, kas raksturīga konkrētam patogēnam. Polimerāzes ķēdes reakcija ļauj vienā materiālā identificēt vairākus dažādus patogēnus.
3. Jutīgums Infekcija, izmantojot šo metodi, tiek atklāta, pat ja tās saturs ir ļoti mazs.
4. Efektivitāte Infekcijas izraisītāja identificēšanai ir nepieciešams ļoti maz laika - tikai dažas stundas.
5. Turklāt polimerāzes ķēdes reakcija palīdz atklāt nevis cilvēka ķermeņa reakciju uz patogēno mikroorganismu iekļūšanu tajā, bet gan konkrētu patogēnu. Sakarā ar to ir iespējams noteikt pacienta slimību pat pirms tā sāk izpausties ar specifiskiem simptomiem.

Šīs diagnostikas metodes trūkumi ietver nepieciešamību stingri ievērot prasības laboratoriju telpu aprīkošanai ar filtriem augsts grāds   tīrīšana tā, lai analīzē ņemtais bioloģiskais materiāls nebūtu piesārņots ar citu dzīvo organismu DNS fragmentiem.

Dažreiz analīze, ko veic ar PCR, var dot negatīvu rezultātu, ja ir acīmredzami noteiktas slimības simptomi. Tas var norādīt uz bioloģiskā materiāla savākšanas noteikumu neievērošanu.

Tajā pašā laikā pozitīvs rezultāts   analīze ne vienmēr ir pierādījums tam, ka pacientam ir noteikta slimība. Tātad, piemēram, pēc apstrādes jau mirušais patogēns uz noteiktu laiku dod pozitīvu PCR analīzes rezultātu.