PGR - polimerazės grandininė reakcija - Tai modernus didelio tikslumo diagnostikos metodas, pagrįstas molekulinės biologijos pasiekimais ir leidžiantis nustatyti viso spektro ligų patogenus, pakartotinai padvigubinant tam tikrus DNR skyrius, veikiant fermentams, dirbtinai sukurtomis sąlygomis (in vitro).

Dėl to nukopijuojami tik tie skyriai, kurie atitinka nurodytus reikalavimus, ir tik tais atvejais, kai juos galima rasti analizuojamame pavyzdyje. Ligos šaltiniui nustatyti pakanka, kad mėginyje būtų bent kelios šio patogeno DNR molekulės.

Dažniausiai PGR naudojama diagnozuojant lytinių organų ir urologines ligas. Į standartinį tyrimų rinkinį už prieinamą kainą paprastai įeina testai, skirti nustatyti 12 patologijų sukėlėjus.

Kaip atliekama PGR?

PGR analizė atskleidžia daugelio ligų bakterijas. Medicinos klinikose tyrimų kompleksas paprastai apima šių bakterijų šaltinių nustatymą:

• chlamidija
• hepatitai B ir C;
• mikoplazmozė;
• ureaplazmozė;
• gardnereliozė (bakterinė vaginozė);
• pienligė (kandidozė);
• infekcinė mononukleozė;
• trichomonozė;
• ŽPV (žmogaus papilomos virusas);
• tuberkuliozė;
• herpes virusas;
• ŽIV AIDS).

Prieš ruošiantis manipuliuoti, reikia laikytis tam tikrų apribojimų. Turėtumėte atsisakyti sekso dieną prieš paskirtos procedūros datą, nenusiminti ir nesikreipti vaistai (antibiotikai, vaistai nuo uždegimo ir kt.). Išvakarėse negalima pusryčiauti ir gerti jokių gėrimų. Vyrai turėtų susilaikyti nuo šlapinimosi likus 2 valandoms iki tyrimo. Atliekant šlapimo gleivinės epitelio ląstelių kasymą (vyrams) gimdos kaklelio kanalas gimdos kaklelis (moterims). Medžiagos mėginių ėmimo procedūra atliekama steriliomis sąlygomis, naudojant specialius prietaisus.

Paskyrimo indikacijos

• neįprastas (per storas, gausus) išskyros iš lytinių takų;
• niežėjimo, deginimo ir skausmo atsiradimas intymių organų srityje;
• praėjus tam tikram laikui po neapsaugoto seksualinio kontakto su atsitiktiniu partneriu;
• siekiant stebėti gydymo efektyvumą;
• prieš chirurginį Urogenitalinių organų gydymą;
• nustatyti nevaisingumo ar persileidimo priežastį.

Gydymo principai

12 infekcijų PGR rezultatą galima gauti praėjus dviem dienoms po tyrimo tepinėlio. prie sveikas žmogus minėtų ligų infekcijos organizme neturėtų būti.

Jei aptinkama kokia nors infekcija, gydymą turėtų skirti tik gydytojas, kuris parašė siuntimą apžiūrai. Vykdant medicinines rekomendacijas, būtina griežtai laikytis visų punktų ir vartoti vaistus nustatytą laiką reikiamomis dozėmis. Priešingu atveju galimas ligos perėjimas į lėtinę formą arba rimtų komplikacijų atsiradimas.

Kontraindikacijos

Praktiškai nėra faktorių, dėl kurių būtų galima uždrausti 12 infekcijų PGR analizę. Manipuliaciją galima atidėti patogesniam laikui tik tuo atveju, jei pacientas jaučiasi blogai arba serga kitomis ligomis (pavyzdžiui, gripu) ūmine forma.

PGR 12, kurio kaina yra gana pagrįsta, leidžia laiku nustatyti pavojingų negalavimų sukėlėjus ir išvengti komplikacijų, kurioms reikia brangesnio gydymo, atsiradimo.

Paslaugos kryptimi " Šiuolaikinė diagnostika"

Klinikos „Modernios diagnostikos“ kryptimi

»Lytiniu būdu plintančių ligų diagnozė ir grandinės polimerazės reakcija (paskaita)

Ligos ir polimerazės grandininės reakcijos laboratorinė diagnozė (paskaita)

daktaras Pokrovskaya M.S.
Corr. RAMS, prof. Smirnovas G.B.
(NIIEM juos. NF Gamalei RAMS ir UAB "LAGIS")

Įvadas

Jau seniai buvo žinoma, kad norint išgydyti pacientą, reikia žinoti, kuo jis tiksliai serga. Ligos tipo nustatymo procesas vadinamas diagnoze. Bet kurios ligos diagnozę nustato gydytojas (remdamasis anamnezės tyrimu, klinikinių apraiškų stebėjimu ir laboratorinių duomenų analize), tada paskiria gydymą. Šiais laikais gydytojas, nustatydamas diagnozę, naudojasi laboratorinių tyrimų duomenimis, be kurių sunku nustatyti teisingą diagnozę arba kai kuriais atvejais tai neįmanoma.

Diagnozės, kaip ligos atpažinimo proceso, svarba yra ta, kad ankstyva, tiksli diagnozė yra racionalaus ir veiksmingo gydymo pagrindas, ir daugeliu atvejų tai galima numatyti. galimi variantai tolimesnė ligos eiga ir baigtis.

Diagnozuojant infekcines ligas, įskaitant Ligos yra svarbios nustatant etiologinį veiksnį (patogeną) ir nustatant ligos stadiją, tai yra, norint gauti etiotropinei ir tinkamai terapijai parinkti reikalingą informaciją, numatyti ligos eigą ir jos baigimo laiką.

Būdingas šiuolaikinis bruožas laboratorinė diagnostika yra nuolatinis naujų tobulinimas ir žinomų metodų bei metodų tobulinimas. Taip yra dėl to, kad m paskutinius dešimtmečius nuolat kinta tiek infekcinių ligų klinikinis vaizdas, tiek jų patogenezės ypatybės. Pavyzdžiui, gerai žinomi gana pavojingi patogenai gali sukelti ištrintas ligų formas arba atvirkščiai: sąlygiškai patogeniški ar laikomi patogeniniais mikroorganizmais sukelia sunkias formas. Keičiasi patogeninių mikroorganizmų tropizmas (paveikiami kiti organai ir audiniai) ir dėl to atsiranda naujos infekcinių procesų formos. Yra lėtinės, nuolatinės infekcijų formos ir keičiasi antigeninė patogenų struktūra, mikroorganizmai virsta nekultūringa būkle. Infekcinių ligų eigos nukrypimai nuo klasikinių formų ir netipinių formų atsiradimas siejami su dviem aplinkybėmis. Pirmiausia pasikeitė imuninės sistemos būklė dalyje gyventojų, imunodeficito būsenos tapo įprasta įvairaus pobūdžio. Antra, keičiasi patys patogenai. T. y., Mes esame mikroorganizmų evoliucijos proceso liudininkai.

Visa tai apsunkina diagnozę ir neigiamai veikia gydymo efektyvumą. Naudojimo vaidmuo šiuolaikiniai metodai laboratoriniai tyrimai diagnozei nustatyti šiuo metu tampa labai reikšmingi.

Infekcinių ligų diagnozavimui naudojami įvairūs laboratoriniai ir instrumentiniai metodai, tarp kurių svarbiausia vieta konkretūs metodaisiekiant nustatyti ligos sukėlėją ir nustatyti etiologinę diagnozę.

Šio pranešimo tema yra pasirinktos infekcinių ligų laboratorinės diagnozės skyriai.

Pagrindinės infekcijų laboratorinės diagnostikos sąvokos ir metodai

Pagrindiniai laboratorinės diagnostikos rodikliai yra infekcijų patogenų (grybelių, pirmuonių, bakterijų ir virusų) identifikavimo metodų jautrumas ir specifiškumas.

• Jautrumas- tai yra minimalus medžiagos kiekis, kurį galima aptikti šiuo metodu. Medžiaga gali būti ištisi mikroorganizmai ir patogeno molekulių fragmentai, taip pat specifiniai antikūnai, kuriuos žmogaus organizmas gamina reaguodamas į infekciją. Kuo mažiau medžiagos gali aptikti metodas, tuo didesnis jo jautrumas. Jei laboratoriniame tyrime neaptikta mėginyje esančių mikroorganizmų, kuriems nustatyti yra sukurta bandymo sistema, rezultatas vadinamas klaidingai neigiamu. Kuo didesnis metodo jautrumas, tuo mažiau klaidingų-neigiamų [klaidingų (-)] rezultatų.
• Specifiškumas- tai metodo galimybė nurodyti, kad mėginyje yra tik tas objektas, kurio aptikimui buvo sukurta bandymo sistema. Jei metodas rodo, kad mėginyje yra mikroorganizmų, kurių jame nėra, rezultatas vadinamas klaidingai teigiamu. Kuo didesnis metodo specifiškumas, tuo mažiau klaidingai teigiamų [klaidingų (+)] rezultatų.

  Visus laboratorinės diagnostikos metodus galima suskirstyti į dvi grupes: tiesioginį ir netiesioginį mikroorganizmų aptikimą.

• Tiesioginiai metodaitaip pavadinta todėl, kad jie tiesiogiai identifikuoja sukėlėjus, sukeliančius infekciją, arba medžiagą, kuri yra patogeno dalis arba kuria ją. Paprastai tai yra antigenai arba genetinė medžiaga. Tiesioginiai metodai yra šie (1 lentelė):

  1 lentelė. Tiesioginės laboratorinės diagnostikos metodai
  Metodai	Metodo principas	Specifiškumas	Jautrumas
  Mikrobiologiniai	Grynos patogeno kultūros išskyrimas	100% aukso standartinė laboratorinė diagnostika	1 000–10 000 ląstelių / ml
  Citologinė (mikroskopija)	Dėmių tepinėlio tyrimas	20-80%	1 000–100 000 ląstelių / ml
  Imunocitologinis ir serologinis	Antigenų identifikavimas prisijungus prie antikūnų RIF, ELISA	70-90%	1 000–100 000 ląstelių / ml
  Molekulinė biologinė	Specifinės DNR / RNR srities nustatymas patogeno genome	99–100% prilygsta „aukso standartui“	200 ląstelių / ml (1 ląstelė vienai reakcijai)

  Klaidingi (+) rezultatai citologinio metodo atveju siejami su rezultatų vertinimo subjektyvumu, imunologinių metodų atveju - su antigenų kryžmine reakcija į antikūnus.

  Melagingi (-) tiesioginių metodų rezultatai gali kilti dėl patogeno neprieinamumo renkant klinikinę medžiagą, dėl mikrobiologinio metodo - dėl mikroorganizmo žūties pervedant mėginį ir nekultūringo pavidalo.

• Netiesioginiai metodaitaip pavadinta todėl, kad medžiagą nustato ne pats patogenas, o specifiniai antikūnai, kuriuos žmonės gamina reaguodami į infekciją tokio tipo, t.y. yra imunologiniai. Tokie metodai apima: komplimentą rišančią reakciją (CSC), netiesioginę imunofluorescencinę reakciją (RNIF), mikroimunofluorescencinę reakciją (MIF), rekombinantinį lipopolisaharidų ELISA (r - ELISA), fermento imunologinį tyrimą (ELISA). Šių metodų jautrumas yra 1000–100000 ląstelių / ml.

  Kai beveik visais atvejais naudojami imunologiniai metodai, klaidingi (+) rezultatai yra susiję su nespecifiniu antikūnų prisijungimu prie antigenų arba kryžmine antigenų reakcija su antikūnais. Melagingi (-) rezultatai atsiranda dėl nepakankamo specifinių antikūnų ar antigenų skaičiaus mėginyje ir nepakankamo nustatymo metodų jautrumo.

  Nepaisant reikšmingų šiuolaikinės laboratorinės diagnostikos laimėjimų, ne vienas metodas praktikoje garantuoja 100% jautrumo ir specifiškumo derinį. Tai reiškia, kad jis nepateikia 100% teisingo atsakymo. Todėl, norėdamas nustatyti diagnozę, gydytojas dažnai naudoja mažiausiai du įvairūs metodai, ir kiekvienas tyrimas geriausiai atliekamas dviem ar trim pakartojimais. Tai yra reikalavimas diagnozuojant tokias ligas kaip tuberkuliozė, chlamidija ir kai kurios kitos (1).

A, M, G klasių imunoglobulinų aptikimo diagnostinė vertė

Leiskite mums išsamiau pasidomėti serologine diagnostika (antikūnų nustatymas kraujo serume ELISA metodu). Tai pagrįsta labai specifinių antikūnų (antikūnų), kurie susidaro žmogaus organizme reaguojant į mikroorganizmus - infekcijų patogenus, nustatymu. Šie antikūnai yra M, A, G klasių imunoglobulinai (Ig). Antikūnai neutralizuoja infekcijos sukėlėjus, sąveikaudami su antigenais. Antigenas yra specifinė infekcijos sukėlėjo (mikroorganizmo) dalis, sukelianti specifinių antikūnų susidarymą žmogaus organizme (imuninis atsakas). Serologinių reakcijų pagrindas yra specifinė antigeno ir antikūno sąveika. Apsvarstykite, ką diagnozė atskleidžia nustatant IgM, IgA, IgG klasių antikūnus (2 lentelė).

2 lentelė. Infekcinės ligos stadijos nustatymas pagal kraujo serume nustatytų antikūnų tyrimo ELISA metodu rezultatus
Ligos stadija (forma)	Antikūnai pagal kraujo serumą	Pavadinimo dinamika (per 2–3 savaites)
Ūmus pirminės infekcijos metu	IgM ⇒ IgG ⇒ IgA arba - IgM ⇒ IgA ⇒ IgG ⇒ ankstyvas ar ankstyvas IgG	Titrų padidėjimas arba sumažėjimas (IgM po 7-os dienos), atsižvelgiant į laiką, praėjusį nuo infekcijos pradžios
Antrinė infekcija ir reaktyvacija (atkrytis)	IgG ⇒ IgA, IgM beveik nėra ⇒ ankstyvas ar ankstyvas IgG	Greitas titrų padidėjimas ar sumažėjimas
Lėtinis	IgG ⇒ IgA, kartais tik IgA arba tik IgG	Nuolatiniai žemi titrai gali būti nuolat aukšti - esant sunkiai kylančiai infekcijai ar sisteminiams pažeidimams.
Patvarumas, vežimas	IgA arba IgG	Nuolatiniai (kelias savaites) žemi titrai (antikūnai ne visada nustatomi dėl pakitusios antigeninės mikroorganizmų struktūros)
Ilgalaikė liga	IgG	Nuosekliai žemos titrai

Kiekybinis įvairių klasių antikūnų nustatymas padeda nustatyti ligos eigą ir pobūdį. Aiškinant kiekybinius rezultatus, būtina atsižvelgti į imuninį atsaką žmogaus kūnas infekcijos vystymasis ir jos pagamintų antikūnų lygis priklauso nuo patogenų savybių, infekcijos proceso stadijos ir individualių imuninės sistemos ypatybių. Esant sunkiam imuninės sistemos slopinimui, AT sintezė gali būti visiškai slopinama. Todėl, norėdamas nustatyti diagnozę, ypač esant netipiškoms infekcijos formoms, gydytojas negali vienareikšmiškai interpretuoti kiekybinio vieno tyrimo rezultato.

Norint teisingai įvertinti antikūnų prieš įvairius infekcijos sukėlėjus kiekybinio aptikimo rezultatus, būtina naudoti porų serumų principą (pakartoti tyrimą po 2–3 savaičių ir palyginti rezultatus). Tokie tyrimai suteikia galimybę išanalizuoti antikūnų nustatymo dinamiką ir tokiu būdu gauti būtina informacija apie infekcinio proceso vystymąsi. Keturiskart padidėjęs antikūnų kiekis per 2–3 savaites rodo infekcijos vystymąsi.

Tam, kad būtų galima atlikti tokius suporuotus tyrimus, reikia kiekybinių ELISA rezultatų.

Tradicinis būdas nustatyti ūminę infekciją yra nustatyti IgM serume. Šiuolaikinės diagnostinių tyrimų sistemos leidžia aptikti ne tik IgM, bet ir kitus ankstyvuosius antikūnus, tokius kaip: 1) IgG prieš ankstyvojo viruso baltymus ir 2) žemos formos IgG. Be to, IgG ankstyviesiems virusų baltymams yra ir pirminės ūminės infekcijos, ir atkryčio (lėtinės infekcijos paūmėjimas), ir pakartotinės infekcijos, t. visi ūminės infekcijos variantai, priešingai nei IgM, gaminami, kaip taisyklė, tik pirminės infekcijos atveju.

Polimerazės grandininė reakcija

Molekulinės diagnostikos metodų įdiegimas į medicinos mikrobiologijos praktiką, be abejo, buvo reikšmingas įvykis, nes jis radikaliai išplėtė ligų patogenezės tyrimo galimybes, iš esmės pagerino diagnostiką ir netgi nubrėžė naujus gydymo metodus. Vis labiau paplitęs yra molekulinės diagnostikos metodas, paremtas PGR, kuris suteikia optimalų didelio jautrumo ir specifiškumo derinį.

Molekulinė diagnostika, o ypač PGR, yra pagrįsta buvimo nustatymu konkrečiame bandinyje. nukleorūgštys, dažniausiai DNR.

DNR yra dvigubos grandinės (dvigubos grandinės) polimero molekulė, kurioje nukleotidų seka lemia visas kūno savybes. Dalijantis ląstelėms, DNR padvigubėja, o tiksli pirminės ląstelės genetinės medžiagos kopija patenka į kiekvieną iš dviejų dukterinių ląstelių. DNR molekulės padvigubinimas vadinamas replikacija. Ant dviejų pradinių (matricinės) DNR grandinių yra pastatytos naujos dukterinės grandinės (papildančios matricą). Replikaciją teikia fermentinis kompleksas, kurio pagrindinis elementas yra DNR polimerazė. Kad DNR polimerazė pradėtų jai replikuoti, be matricos, reikalinga sėkla (pradmuo) - nedidelis DNR fragmentas, papildantis matricą. Ši sėklos DNR polimerazė tarsi prailgėja, pastatydama naują DNR grandinę ant esamos matricos. Paprastai visa ląstelės arba viruso DNR yra gamtoje atkartojama, o šio proceso rezultatas yra dvi identiškos originalios DNR kopijos.

Dabar, kai trumpai priminome svarbiausią dalyką, susijusį su replikacija, galime pereiti prie polimerazės grandininės reakcijos aprašymo. PGR buvo atidaryta 1983 m. Ir dabar plačiai naudojama moksliniams ir praktiniams tyrimams infekcinių ir genetinių ligų diagnozavimo, ankstyvos kai kurių onkologinių patologijų diagnozės srityje. Už šio metodo atradimą Carey Mullis 1995 m. Buvo apdovanotas prestižiškiausiu mokslo apdovanojimu - Nobelio premija.

Šios reakcijos metu DNR taip pat pakartojama, bet ne taip, kaip įprasta gamtoje. Pirmiausia atkartojama ne visa mikroorganizmo DNR, o tik mažas jo fragmentas (taikinys).

Antra, PGR produktas yra ne dvi, o milijonai originalaus tikslo kopijų. Toks daugybinis pakartojimas vadinamas amplifikacija.

prie skirtingos rūšys ir bakterijų rūšys, taip pat virusai, skiriasi genetiniai tekstai (DNR nukleotidų sekos). Šiuolaikiška kompiuterių programos yra įvairių organizmų iššifruotų DNR sekų duomenų bazė. Kuriant diagnostinę PGR tyrimo sistemą, randamas nedidelis DNR fragmentas (taikinys), griežtai būdingas konkrečiam patogenui. Naudojant PGR, ši sritis amplifikuojama ir amplifikacijos produktas (amplikonas) identifikuojamas agarozės gelio elektroforezės būdu.

Identifikuojant tam tikro mikroorganizmo specifinį DNR fragmentą, mikroorganizmas nustatomas.

Kiekvienas infekcijos diagnozavimo ciklas vyksta trimis etapais (pav.):

1. Denatūracija - dvigubų DNR grandinių audimas - nėra fermentinis procesas, vykstantis 95 0 C temperatūroje.
2. Gruntų prisijungimas (atkaitinimas). Norėdami pradėti replikacijos procesą PGR, naudojami pradmenys - trumpos viengrandės DNR (15–30 bazių ilgio), kurios pridedamos pertekliniai į reakcijos mišinį. Jie specialiai (pagal papildomos poros principą) tvirtinami prie trumpų skyrių, kurie riboja pasirinktą taikinį. Šis etapas nėra fermentinis ir vyksta reakcijos mišinio inkubacijos metu esant 55–65 0 С temperatūrai. Gruntai prisijungia tik prie pasirinktų DNR fragmentų, būdingų šiam patogenui, ir nesąveikauja su jokiomis kitomis DNR sekomis (o klinikiniame pavyzdyje yra daugybė DNR, kaip ir žmogaus). ir įvairūs mikroorganizmai). Būtent tai užtikrina absoliučią diagnostinės PGR tyrimo sistemos specifiškumą. Pertekliniai DNR pradmenys šabloninės DNR atžvilgiu užtikrina aukštą metodo jautrumą. T. y., 100% tikimybė, kad pradiniame PGR tirpale pradmenys ras aptikimo taikinį.
3. Pridėjus pradmenis, susidaro struktūros [DNR matrica + gruntas], kurios yra „sėkliniai“ kompleksai. Pradmenų užpildymas pradedamas nuo 3-iųjų pabaigos, atliekant papildomą sintezę ant viengrandžių DNR fragmentų šablonų. Šis procesas atliekamas naudojant specialų fermentą - Taq polimerazę (karščiui atsparią DNR polimerazę) ir nukleotidus (kaip statybinę medžiagą).

   Naujai susintetinta dvigrandė DNR po denatūravimo etapo vėl suriša pradmenis, kurių perteklius yra mišinyje. Gautos struktūros po užbaigimo sudaro specifinius DNR fragmentus, apribotus pradmenų sekomis. Taigi, net jei tik viena DNR molekulė buvo pradinis PGR, amplifikacija vyksta per 25–40 ciklų, t. yra sintetinamas didelis skaičius (108-109 egzempliorių) specifinių DNR fragmentų (amplikonų), kurių pakanka vizualiai užregistruoti reakcijos rezultatą po agarozės gelio elektroforezės.

PGR atliekama cikleratoriuje arba termocikleris - įtaisas, kuriame cikliškai automatiškai atliekamas iš anksto nustatytas temperatūros keitimo režimas, leidžiantis keliems etapams pakartotinai praeiti 1, 2, 3.

Reakcija vykdoma naudojant agarozės gelio elektroforezę. Neigiamai įkrautos DNR molekulės juda gelyje veikdamos elektrinis laukas nuo katodo iki anodo, o DNR fragmentų kelio ilgis tam tikrą laiką priklauso nuo jų dydžio. Gelyje esanti DNR dažoma etidžio bromidu, todėl ji tampa matoma ultravioletinėje šviesoje. Jei mėginyje dėl PGR susikaupia amplikonai (tokio paties dydžio DNR fragmentai), jie bus tokiu pat atstumu nuo pradžios ir bus matomi kaip juostelė gelio takelyje. Jei juostelės padėtis ant gelio takelio atitinka apskaičiuotą panaudotų pradmenų porai, t. yra tokiu pat atstumu nuo pradžios kaip teigiamos kontrolės juostelės, tai reiškia, kad tyrimo rezultatas yra teigiamas.

Kaip ir kiekviename eksperimente, atsižvelgiant į PGR rezultatus, pateikiamos kontrolinės - teigiamos ir neigiamos. Bet kuri diagnostinių tyrimų sistema turi turėti patvirtintą grafiką, kuriame nurodytos minėtos kontrolės priemonės.

Teigiama kontrolė yra mėginys su DNR matrica, kad būtų sukauptas specifinis amplikonas, atitinkantis aptinkamą mikroorganizmą.

Neigiama kontrolė yra vanduo, žmogaus DNR arba mikroorganizmų, glaudžiai susijusių su apibrėžta bandymo sistema, DNR.

PGR metodo pranašumai

PGR diagnostika yra vienas moderniausių ir pažangiausių laboratorinės diagnostikos metodų, leidžiančių specifiškai nustatyti pavienių užkrečiamųjų ligų sukėlėjų ląstelių DNR.

yra esminis skirtumas bet kurių kitų tradicinių metodų molekulinės diagnostikos metodai, įskaitant PGR. Šis skirtumas yra tas, kad tradiciniai metodai atskleidžia mikroorganizmų genų (baltymų, antigenų ir sudėtingesnių organizuotų veikėjų) aktyvumo produktus, o PGR tiesiogiai atskleidžia genetinę medžiagą. Taigi mikroorganizmas aptinkamas PGR, neatsižvelgiant į genomo funkcionavimo ypatybes, netipines apraiškas.

Galima sakyti, kad PGR pasiekia maksimalų įmanomą jautrumą. PGR tyrimo sistemų jautrumas yra 10-1000 ląstelių mėginyje, tuo tarpu imunologinių ir mikroskopinių metodų jautrumas yra 1000-100000 ląstelių mėginyje. Dėl didelio jautrumo PGR pagrįstos tyrimo sistemos yra būtinos tais atvejais, kai tiriamos medžiagos (patogeno) yra labai mažai.

Dėl didelio jautrumo PGR tyrimai leidžia ankstyva diagnozė ligos (pvz., per įprastiniai tyrimai populiacija), patikslinti diagnozę antibiotikų terapijos fone, patikrinti išgydymą (gydymo veiksmingumą), taip pat aptikti patvarius mikroorganizmus. Kai kurių patogenų, tokių kaip Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, diagnostinių PGR tyrimų sistemų jautrumas neturėtų būti didelis. Jautrumo rodikliai yra specialiai sukurti ir patvirtinti, pradedant nuo 105–6 ląstelių viename mililitre. Tokios bandymo sistemos nustato diagnostiškai reikšmingą šių mikroorganizmų kiekį (2,3).

Nustatant sunkiai auginamas, nekultūringas ir patvarias patogeninių mikroorganizmų formas, reikiamą diagnostinį atsaką suteikia tik tiesioginis patogeno DNR aptikimo metodas. Kiti diagnostiniai metodai (imunologiniai, bakteriologiniai, mikroskopiniai) yra sunkūs ar net neįmanomi. Patvarių mikroorganizmų atveju tai gali atsirasti dėl patogenų antigeninės struktūros pokyčių arba dėl tokių mikroorganizmų perėjimo į nekultūringą formą. Tai reikia atsiminti diagnozuojant latentines ir lėtines infekcijas.

Aukštą PGR metodo specifiškumą lemia pradmenų nukleotidų seka ir jų prijungimo prie specifinio patogeno specifinio DNR fragmento (taikinio) sąlygos, kurios buvo specialiai parengtos kuriant PGR tyrimo sistemą. Priklausomai nuo pasirinktų pradmenų, PGR tyrimo sistema gali diferencijuoti tų pačių rūšių mikroorganizmų genus, rūšis, serotipus ir net patogeniškus bei nepatogeniškus kamienus.

Naudojant PGR infekcijų diagnozei, galima nustatyti patogenų jautrumą (arba atsparumą) daugeliui naudojamų antibiotikų. Tai ypač pasakytina apie tuos atvejus, kai neįmanoma pritaikyti mikrobiologinio tyrimo metodo.

PCR analizei tinka bet kuri klinikinė medžiaga, kurioje gali būti infekcijos patogenų - kraujas, serumas, plovimo skystis, skrepliai, seilės, skrandžio sultys, biopsijos medžiaga, tepinėliai, tamponai. Tiriama medžiaga gali būti daiktų pavyzdžiai išorinė aplinka (praplovimai, pirštų atspaudai, tepinėliai, vanduo, dirvožemis ir kt.).

PGR yra vieningas ir automatizuotas metodas, leidžiantis standartiškai laikytis taisyklių, patvirtintų 2006 m leidimus naudoti šią PGR tyrimo sistemą ir užtikrina aukštą rezultatų tikslumą ir atkuriamumą.

PGR laboratorinė diagnostika - greita ir patikimas būdas infekcinių ligų patogenų identifikavimas. PGR laboratorija pateikia atsakymą praėjus 48 valandoms nuo medžiagos pristatymo į tyrimą dienos. ( Grynas laikas kiekvieno pavyzdžio tyrimas yra tik kelios valandos.)

Viename klinikiniame mėginyje vienu metu galima nustatyti daugiau kaip 20 patogenų.

Svarbus aspektas atliekant klinikinio mėginio tyrimą yra atitiktis klinikinės medžiagos rinkimo ir saugojimo taisyklės. Čia yra tik keletas bendrų rekomendacijų:

• Klinikinė medžiaga yra paimta iš numatytų mikroorganizmų buveinių ir infekcijos išsivystymo (tam reikia atsižvelgti į įėjimo vartus, pasiskirstymo kelius, veisimosi vietas ir norimų mikroorganizmų išskyrimo kelius).
• Surinktoje medžiagoje turi būti mažai teršalų (ne daugiau kaip „su degtuko galvute“). Perteklinės išskyros, gleivės ir pūliai neigiamai veikia DNR išgavimo kokybę ir prisideda prie DNR skaidymo saugojimo ir transportavimo metu.
• Klinikinei medžiagai rinkti naudokite tik vienkartinius šepetėlius ar tamponus. Gamindami klinikinę medžiagą laboratoriniame mėgintuvėlyje su tirpalu, stebėkite sterilumą.

Molekulinės diagnostikos aktualumas

Vienas is labiausiai ryškūs pavyzdžiai, parodantis molekulinės diagnostikos svarbą, yra žmogaus papilomos virusų užkrėtimas, sukeliantis didelę onkogeninę riziką. Ne visi papilomos virusai sukelia piktybinį augimą. Išskirkite virusų, sukeliančių vėžį, genotipus su didele tikimybe, ir vadinamuosius gerybinius genotipus. Pirmieji apima 16, 18 (mūsų regione paplitę) genotipus, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 68 (ME180), MM4 (W13B), MM7 ( P291) ir MM9 (P238A). Į gerybinius genotipus įeina 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66 ir MM8 (P155). Papilomos viruso genotipą galima nustatyti naudojant PGR (4,5).

16.18 tipo papilomos virusas išlieka ląstelėse pleiskanotas epitelis gimdos kaklelis, nesukeldamas klinikinių apraiškų metų metus (iki 5 metų inkubacijos periodo), iki pastebimų neoplazijų susidarymo momento. Ankstyva diagnozė tokiais atvejais įmanoma tik sergant profilaktiniai tyrimai gyventojų, naudojančių PGR. Aptikus papilomos viruso tipų DNR, sukeliančius vėžį su didele tikimybe, pacientas turėtų pasitarti su onkologu, apsilankyti pas jį kartą per mėnesį, stebėti klinikines apraiškas. Taigi PGR tokiu atveju leidžia atlikti ankstyvą diagnozę, kuri padeda išvengti gimdos kaklelio vėžio ar jo nepradėti.

Kai kuriais atvejais patogenai negali būti atskirti klasikiniais mikrobiologiniais metodais tam tikrais ligos etapais. Taip yra dėl to, kad mikroorganizmai gali būti epitelio ląstelių viduje, audiniuose ar gleivėse (pavyzdžiui, chlamidijoms, mikoplazmoms, ureaplazmoms. Visiems virusams būdinga tarpląstelinė lokalizacija, o trichomonadai ir gonokokai gali būti tiek tarpląsteliniai, tiek tarpląsteliniai). Be to, kai kurios bakterijos, veikiamos tam tikrų veiksnių, gali pereiti į vadinamąsias nekultūringas formas arba nekultūringą būseną. Pavyzdys yra medicininiai chlamidijos tyrimai. Chlamydia trachomatis aptikimo trukmė infekcijos vietoje buvo palyginta naudojant audinių auginimo metodus, tiesioginę fluorescenciją, PGR (DNR nustatymas) ir Western blot (RNR nustatymas) metodus. Buvo nustatyta, kad nukleino rūgščių nustatymo metodai nustato patogeną protrūkio metu 4 savaites ilgiau (16 savaičių, palyginti su 12 savaičių po pirminės infekcijos) nei tradiciniai metodai. Šiame darbe buvo padaryta išvada apie chlamidijos perėjimo galimybę infekcinio proceso metu į nekultūringą būseną. Esant tokiai būsenai, chlamidija ir toliau sukelia uždegimą arba išlieka epitelio ląstelėse, tačiau mikrobiologiniu metodu neaptinkama (6).

Šiuo metu yra sukaupta labai daug medžiagos, rodančios molekulinės diagnostikos svarbą, tačiau dėl ribotos šio leidinio apimties negalime svarstyti kitų pavyzdžių.

Laboratorinės diagnostikos metodų naudojimo strategija

Ant moderni scena užkrečiamųjų ligų laboratorinės diagnozės sukūrimas, akivaizdus integruoto požiūrio poreikis, kurį sudaro įvairių laboratorinių metodų naudojimas nustatant infekcinės ligos etiologinę diagnozę. Ištyręs anamnezę ir klinikines apraiškas, gydytojas nusprendžia naudoti tam tikrą laboratorinių tyrimų metodą. Skirtingi deriniai metodai naudojami priklausomai nuo patogenų biologijos ypatybių ir jų sąveikos su žmogaus imunine sistema, taip pat nuo ligos formos.

Pavyzdžiui, chlamidijų, herpes virusų, toksoplazmų laboratorinei diagnozei analizuojami PGR ir ELISA tyrimų rezultatai. O mikoplazmozės ir ureaplazmozės laboratorinėje diagnozėje naudojamas PGR derinys su kultūrų atranka, nustatant jautrumą antibiotikams. Nespecifinei sąlygiškai patogeniškai mikroflorai nustatyti naudojama tepinėlių mikroskopija ir mikrobiologinis kultūrų išskyrimo metodas.

Gydytojas nustato diagnozę, remdamasis paciento anamnezės, klinikinių apraiškų ir laboratorinės diagnostikos duomenimis.

Literatūra:

• Lytiniu keliu plintančios infekcijos, Nr. 2, 2002, 21–24 psl. Urogenitalinė chlamidinė infekcija. Diagnozės ir terapijos metodai. G.A. Dmitrijevas, Rusijos Federacijos TsNIKVI sveikatos apsaugos ministerija, Maskva.
• Vadovėlis. Visos Rusijos švietimo-mokslinis-metodinis tęstinio medicinos ir farmacijos mokymo centras. Maskva, 1999 m. Makšties mikroekologija. Makšties disbiozės mikrofloros korekcija. V.M. Koršunovas, ... L.I. Kafarskaja, ... V.V. Smejanovas. Rusijos Federacijos Sveikatos apsaugos ministerija, RSMU, MIMSR, RMAPO, Maskva.
• Lytiškai plintančios infekcijos, Nr. 1, 2002, p. 8-15. Dabartinė būsena klausimas apie Ureaplasma urealiticum reikšmę urogenitalinių ligų genezėje. IN IR. Kisina, O.S. Zagrebina, K.I. Zabirovas, V.V. Maišai. TSNIKVI Rusijos Federacijos sveikatos ministerija, Sveikatos apsaugos ministerijos miesto klinikinė ligoninė Nr. 47, Maskva.
• Kancerogenezė. Autorių kolega redagavo D.G. Zaridze. Mokslo pasaulis, 2000 m., Maskva. Papilomos virusai ir jų vaidmuo gimdos kaklelio kancerogenezėje. F.L. Kiselevas. Onkologinis Mokslo centras RAMOS.
• Medicininė laboratorinė diagnostika (programos ir algoritmai). Rodyklę redagavo prof.A.I. Karpishchenko, 2001 m., „Intermedika“, Sankt Peterburgas.
• Užkrėsti. Imun., 1992 m. Gegužė, 2040-2047, tomas 60, Nr. 5. Chlamidijinės RNR ir DNR parodymas neigiamos kultūros sąlygomis. SM Holland, ... HR Taylor. Infekcinių ligų skyrius, Johns Hopkins ligoninė, Baltimorė, Merilandas.

Biologiniam PGR gali būti naudojamos įvairios biologinės medžiagos, kuriose gali būti mikrobų ar jų fragmentų.

Norint nustatyti vyrų ir moterų lytinių organų infekcijas, atlikti analizę, išskiriant iš lytinių organų tepinėlį iš šlaplėtepinėlis iš gimdos kaklelio, taip pat šlapimas.

Norint diagnozuoti virusinį hepatitą C ir ŽIV infekciją, imamas kraujas analizei.

Tam, kad būtų diagnozuota infekcinė mononukleozė, gali būti naudojamas gerklės tamponas.

Prieš apžiūrėdami, būtinai pasitarkite su gydytoju, kokios medžiagos bus naudojamos analizei.

PGR rezultatų aiškinimas ir interpretavimas

Galimi šie PGR analizės rezultatai:

Neigiamas rezultatas reiškia, kad biologinėje medžiagoje, kuri buvo tiriama, infekcijos pėdsakų nerasta. Daugeliu atvejų neigiamas rezultatas PGR analizė rodo, kad žmogaus organizme nėra infekcijos, kurios pėdsakų buvo bandoma nustatyti apžiūrint.

Teigiamas rezultatas reiškia, kad biologinėje medžiagoje, kuri buvo tiriama, buvo aptikti infekcijos pėdsakai. Teigiamas PGR rezultatas su dideliu tikslumu rodo tam tikros infekcijos buvimą.

Ar tikslus PGR yra tikslus diagnozuojant infekcijas?

PGR metodas yra labai tikslus, specifiškas ir jautrus. Tai reiškia kad ši analizė sugebantis:

1. tiksliai nustatyti infekcijos buvimą ar nebuvimą;
2. tiksliai nurodykite, kokia infekcija (specifiškumas);
3. aptikti infekciją net ir esant labai mažai ištirtos biologinės medžiagos mikrobų DNR (jautrumas).

Skirtingai nei su fermentais susijęs imunosorbentų tyrimas (ELISA) ir kiti imunologiniai infekcijos diagnozavimo metodai, PGR daug rečiau duos klaidingai neigiamus rezultatus (analizė parodo, kad infekcijos nėra, o ji iš tikrųjų yra) ir beveik niekada neteikia klaidingų teigiamų rezultatų (analizė rodo infekcijos buvimas, o jos iš tikrųjų nėra).

PGR, arba kitaip polimerazės grandininė reakcija, yra įvairių infekcinių ligų laboratorinės diagnostikos metodas.

Šį metodą Carey Mullis sukūrė 1983 m. Iš pradžių PGR buvo naudojama tik moksliniais tikslais, tačiau po kurio laiko ji buvo įvesta į praktinės medicinos sritį.

Metodo esmė - nustatyti infekcijos sukėlėją DNR ir RNR fragmentuose. Kiekvienas patogenas turi savo etaloninį DNR fragmentą, kuris sukuria daugybę jo kopijų. Jis lyginamas su esama duomenų baze, kurioje yra informacijos apie DNR struktūrą. skirtingi tipai mikroorganizmai.

Naudodamiesi polimerazės grandinine reakcija, galite ne tik nustatyti infekciją, bet ir įvertinti ją kiekybiškai.

Kada naudojama PGR diagnostika?

Analizė biologinė medžiagaatliekamas naudojant PGR, padeda nustatyti įvairias urogenitalines infekcijas, įskaitant latentines, kurios nepasireiškia specialiais simptomais.

Šis tyrimo metodas leidžia nustatyti tokias žmogaus infekcijas:

• abiejų tipų herpes simplex virusas;
• ŽIV infekcija
• chlamidija
• ureaplazmozė;
• kandidozė;
• mikoplazmozė;
• trichomonozė;
• taip pat hepatitai B ir C, tuberkuliozė, helikobakteriozė, infekcinė mononukleozė.

Ruošiantis nėštumui ir jo metu moteriai būtinai nustatomas PGR įvairių lytinių organų infekcijų diagnozei nustatyti.

Biologinė medžiaga PGR tyrimams

Norėdami aptikti infekcijas pagal PGR, galima naudoti:

• šlapimas, tepinėlis iš gimdos kaklelio kanalo (moterims), tepinėlis iš šlaplės, išskyros iš lytinių organų - lytinių organų infekcijai tirti;
• kraujas - tirti dėl ŽIV infekcijos ir hepatito C;
• gerklės tamponas - infekcinei mononukleozei nustatyti.

Infekcijų PGR diagnozavimo privalumai ir trūkumai

Infekcijų PGR tyrimų privalumai yra šie:

1. Universalumas - kai kiti diagnostikos metodai yra bejėgiai, PGR nustato bet kokias RNR ir DNR.
2. Specifiškumas. Tiriamojoje medžiagoje, naudojant šį metodą, nustatoma tam tikram patogenui būdinga nukleotidų seka. Polimerazės grandininė reakcija leidžia identifikuoti kelis skirtingus patogenus toje pačioje medžiagoje.
3. Jautrumas. Infekcija naudojant šį metodą nustatoma, net jei jo kiekis yra labai mažas.
4. Efektyvumas Infekcijos sukėlėjui nustatyti reikia labai mažai laiko - vos kelios valandos.
5. Be to, polimerazės grandininė reakcija padeda nustatyti ne žmogaus kūno reakciją į patogeninių mikroorganizmų įsiskverbimą į jį, bet specifinį patogeną. Dėl šios priežasties galima nustatyti ligonio ligą dar prieš pradedant pasireikšti specifiniais simptomais.

Prie to „minusų“ diagnostinis metodas apima būtinybę griežtai laikytis laboratorijų patalpų įrengimo filtrais reikalavimų aukštas laipsnis valymas kad biologinė medžiaga, paimta analizuoti, nebūtų užteršta kitų gyvų organizmų DNR fragmentais.

Kartais PGR atlikta analizė gali duoti neigiamą rezultatą esant akivaizdiems tam tikros ligos simptomams. Tai gali reikšti biologinės medžiagos rinkimo taisyklių nesilaikymą.

Tuo pačiu metu teigiamas rezultatas analizė ne visada įrodo, kad pacientas serga konkrečia liga. Taigi, pavyzdžiui, po gydymo jau miręs patogenas tam tikrą laiką duoda teigiamą PGR analizės rezultatą.