ПЦР – полимеразная цепная реакция – представляет собой современный высокоточный способ диагностики, основанный на достижениях молекулярной биологии и позволяющий установить наличие возбудителей целого спектра заболеваний путем многократного удвоения некоторых участков ДНК под воздействием ферментов в искусственно созданных условиях (инвитро).

В результате осуществляется копирование только тех участков, которые отвечают заданным требованиям, и исключительно в случаях, когда они имеются в анализируемом образце. Для выявления источника болезни достаточно, чтобы в пробе было хотя бы несколько молекул ДНК данного возбудителя.

Наиболее часто метод ПЦР используют для диагностики половых и урологических болезней. В стандартный комплекс исследований по доступной цене обычно включено назначение анализов на выявление возбудителей 12 патологий.

Как проводится ПЦР?

ПЦР-анализ позволяет выявить бактерий множества заболеваний. В медицинских клиниках в комплекс исследований обычно включают выявление источников следующих бактерий:

• хламидиоз;
• гепатиты В и С;
• микоплазмоз;
• уреаплазмоз;
• гарднереллез (бактериальный вагиноз);
• молочница (кандидоз);
• инфекционный мононуклеоз;
• трихомониаз;
• ВПЧ (вирус папилломы человека);
• туберкулез;
• вирус герпеса;
• ВИЧ (СПИД).

Перед подготовкой к манипуляции необходимо соблюдать некоторые ограничения. Следует отказаться от половых контактов в течение суток до даты назначенной процедуры, не выполнять спринцевания и не применять лекарственные средства (антибиотики, противовоспалительные препараты и др.). Утром накануне нельзя завтракать и пить какие-либо напитки. Мужчинам следует воздержаться от мочеиспускания за 2 часа до обследования. При проведении выполняется соскоб клеток эпителия слизистой оболочки уретры (у пациентов мужского пола) или цервикального канала шейки матки (у женщин). Процедура забора материала проводится в стерильных условиях с использованием специальных приспособлений.

Показания к назначению

• необычные (слишком густые, обильные) выделения из половых путей;
• появление зуда, жжения и рези в области интимных органов;
• через некоторое время после незащищенного полового контакта со случайным партнером;
• с целью осуществления контроля за эффективностью лечения;
• перед оперативным лечением мочеполовых органов;
• для установления причины бесплодия или невынашивания беременности.

Принципы лечения

Результат ПЦР- на 12 инфекций может быть получен уже через два дня после взятия мазка на анализ. У здорового человека инфекции вышеперечисленных заболеваний в организме должны отсутствовать.

В случае выявления какой-либо инфекции лечение должно быть назначено исключительно врачом, который выписал направление на обследование. В процессе выполнения врачебных рекомендаций необходимо строго выполнять все пункты и принимать препараты в течение установленного времени в необходимой дозировке. В противном случае возможен переход заболевания в хроническую форму или появление серьезных осложнений.

Противопоказания

Каких-либо факторов, при которых анализ ПЦР 12 инфекций может быть запрещен пациенту, практически не существует. Проведение манипуляции может быть перенесено на более удобное время лишь при плохом самочувствии пациента или наличии у него других заболеваний (например, грипп) в острой форме.

ПЦР 12, цена которой является вполне приемлемой, позволяет вовремя обнаружить возбудителей опасных недугов и избежать появления осложнений, требующих проведения более дорогостоящего лечения.

Услуги по направлению "Современная диагностика"

Клиники по направлению "Современная диагностика"

» Лабораторная диагностика ЗППП и полимеразная цепная реакция (лекция)

Лабораторная диагностика ЗППП и полимеразная цепная реакция (лекция)

к.б.н. Покровская М.С.,
чл.-корр. РАМН, проф. Смирнов Г.Б.
(НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН и АО «ЛАГИС»)

Введение

Давно и хорошо известно, что для того, чтобы вылечить больного, нужно знать, чем именно он болен. Процесс определения типа болезни называется диагностикой. Диагноз при любой болезни ставит врач (на основании изучения анамнеза, наблюдения клинических проявлений и анализа данных лабораторных исследований), после чего назначает лечение. В наши дни при постановке диагноза врач использует данные лабораторных исследований, без которых поставить правильный диагноз либо затруднительно, либо в ряде случаев вообще невозможно.

Значение диагностики как процесса распознавания болезней состоит в том, что ранний, точный диагноз является основой для проведения рациональной и эффективной терапии, позволяет в большинстве случаев предсказать возможные варианты дальнейшего течения и исхода заболевания.

При диагностике инфекционных болезней, в т.ч. ЗППП важно выявить этиологический фактор (возбудителя) и установить стадию заболевания, то есть получить сведения необходимые для выбора этиотропной и адекватной терапии, предсказать ход болезни и сроки её завершения.

Характерными чертами современной лабораторной диагностики являются постоянная разработка новых и совершенствование известных методов и приёмов. Это обусловлено тем, что в последние десятилетия наблюдается непрерывное изменение как клинической картины инфекционных заболеваний, так и особенностей их патогенеза. Например, известные достаточно опасные возбудители могут вызывать стёртые формы болезней или наоборот: условно-патогенные или считавшиеся непатогенными микроорганизмы становятся причиной тяжелых форм. Меняется тропность патогенных микроорганизмов (поражают другие органы и ткани) и, как следствие, появляются новые формы инфекционных процессов. Возникают хронические, персистирующие формы инфекций и изменяется антигенная структура возбудителей, микроорганизмы переходят в некультивируемой состояние. Отклонения от классических форм протекания инфекционных заболеваний и возникновение атипичных форм связаны с двумя обстоятельствами. Во-первых, у части населения изменилось состояние иммунной системы, стали распространенными иммунодефицитные состояния различной природы. Во-вторых, меняются сами возбудители инфекций. То есть, мы являемся свидетелями эволюционного процесса у микроорганизмов.

Все это затрудняет диагностику и отрицательно сказывается на эффективности лечения. Роль использования современных методов лабораторных исследований для постановки диагноза становится в настоящее время весьма значительной.

Для диагностики инфекционных болезней используются различные лабораторно-инструментальные методы, среди которых важнейшее место занимают специфические методы, имеющие целью выявить возбудителя заболевания и установить, таким образом, этиологический диагноз.

Предметом данного сообщения являются избранные разделы лабораторной диагностики инфекционных болезней.

Основные понятия и методы лабораторной диагностики инфекций

Ключевыми показателями лабораторной диагностики являются чувствительность и специфичность методов выявления возбудителей инфекций (грибов, простейших, бактерий и вирусов).

• Чувствительность - это минимальное количество материала, которое можно выявить данным методом. Материалом могут быть целые микроорганизмы и фрагменты молекул возбудителей, а также специфические антитела, выработанные человеческим организмом в ответ на инфекцию. Чем меньше материала способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Если лабораторное исследование не выявляет микрорганизмы, которые присутствуют в образце и для выявления которых разработана тест-система, результат называется ложно-отрицательным. Чем выше чувствительность метода, тем меньше ложно-отрицательных [ложно(-)] результатов.
• Специфичность - это способность метода указывать на наличие в образце только того объекта, для выявления которого была разработана тест-система. Если метод указывает на наличие в образце микроорганизмов, которые там не содержатся, результат называется ложно-положительным. Чем выше специфичность метода, тем меньше ложно-положительных [ложно (+)] результатов.

  Все методы лабораторной диагностики можно разделить на две группы: методы прямого и непрямого выявления микроорганизмов.

• Прямые методы названы так потому, что выявляют непосредственно возбудителей инфекций или материал, входящий в состав возбудителя, или им продуцируемый. Обычно это антигены или генетический материал. К числу прямых методов относятся следующие (табл. 1):

  Таблица 1. Прямые методы лабораторной диагностики
  Методы	Принцип метода	Специфичность	Чувствительность
  Микробиологический	Выделение чистой культуры возбудителя	100% “золотой стандарт” лабораторной диагностики	1 000-10 000 кл/ мл
  Цитологический (микроскопия)	Исследование окрашенных мазков	20-80%	1 000-100 000 кл/ мл
  Иммуноцитологический и серологический	Выявление антигенов после связывания с антителами РИФ, ИФА	70-90%	1 000-100 000 кл/ мл
  Молекулярно-биологический	Определение специфического участка ДНК/ РНК в геноме возбудителя	99-100% приравнивается к “золотому стандарту”	200 кл/мл (1 клетка в реакции)

  Ложно(+) результаты связаны в случае цитологического метода с субъективностью оценки результатов, в случае иммунологических методов - с перекрестным реагированием антигенов с антителами.

  Ложно(-) результаты в прямых методах могут быть обусловлены недоступностью возбудителя во время забора клинического материала, для микробиологического метода - гибелью микроорганизма в процессе транспортировки образца и в случае некультивируемой формы.

• Непрямые методы названы так потому, что выявляют материал не самого возбудителя, а специфические антитела, выработанные человеком в ответ на инфекцию данного типа, т.е. являются иммунологическими. К таким методам относятся: реакция связывания комплимента (РСК), реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), реакция микроиммунофлуорес ценции (МИФ), рекомбинантный липополисахаридный ИФА (r - ELISA), иммуноферментный анализ (ИФА). Чувствительность этих методов - 1000-100000 кл/мл.

  При использовании иммунологических методов практически во всех случаях ложно(+) результаты связаны с неспецифическим связыванием антител с антигенами или перекрёстным реагированием антигенов с антителами. Ложно(-) результаты возникают из-за недостаточного количества специфических антител или антигенов в пробе и недостаточной чувствительности методов определения.

  Несмотря на значительные успехи современной лабораторной диагностикой ни один метод на практике не гарантирует сочетания 100% чувствительности и специфичности. А значит не дает 100% верного ответа. Поэтому для постановки диагноза врачу нередко необходимо использовать минимум два различных метода, причем каждое исследование лучше проводить в двух- или трёхкратном повторении. Это является требованием при диагностике таких болезней, как туберкулёз, хламидиоз и ряда других (1).

Диагностическое значение выявления иммуноглобулинов классов А, М, G

Остановимся подробнее на серологической диагностике (определение антител в сыворотке крови методом ИФА). Она основывается на определении очень специфических антител (АТ), образующихся в организме человека в ответ на присутствие микроорганизмов - возбудителей инфекций. Эти АТ представляют собой иммуноглобулины (Ig) классов М, А, G. Антитела нейтрализуют инфекционные агенты, взаимодействуя с антигенами. Антиген - это специфическая часть инфекционного агента (микроорганизма), которая вызывает в человеческом организме образование специфических антител (иммунный ответ). Основой серологических реакций является специфическое взаимодействие антиген-антитело. Рассмотрим, что дает для постановки диагноза выявление АТ классов IgM, IgA, IgG (Табл. 2).

Таблица 2. Определение стадии инфекционного заболевания по результатам исследования антител в сыворотке крови методом ИФА
Стадия (форма) заболевания	Антитела в порядке появления в сыворотке крови	Динамика титров (в интервале 2-3 недели)
Острая при первичном инфицировании	IgM ⇒ IgG ⇒ IgA или - IgM ⇒ IgA ⇒ IgG ⇒ ранние или предранние IgG	Нарастание титров или снижение (IgM после 7-го дня), - в зависимости от времени, прошедшего с начала развития инфекции
Вторичное инфицирование и реактивация (рецидив)	IgG ⇒ IgA, почти полное отсутствие IgM ⇒ ранние или предранние IgG	Быстрое нарастание или снижение титров
Хроническая	IgG ⇒ IgA, иногда только IgA или только IgG	Постоянные невысокие титры, могут быть постоянно высокими - в случае тяжелой восходящей инфекции или системных поражений.
Персистенция, носительство	IgA или IgG	Постоянные (несколько недель) низкие титры (АТ не всегда выявляются из-за изменённой антигенной структуры микроорганизмов)
Давно перенесённая болезнь	IgG	Стабильно низкие титры

Количественное определение антител различных классов помогает определить стадию и характер течения заболевания. При трактовке количественных результатов необходимо учитывать, что иммунный ответ человеческого организма на развитие инфекции и уровень вырабатываемых им антител зависят от особенностей возбудителей, стадии инфекционного процесса и индивидуальных особенностей иммунной системы. В случае выраженной иммуносупрессии синтез АТ может быть полностью подавлен. Поэтому для постановки диагноза, особенно при атипичных формах протекания инфекций, врач не может однозначно трактовать количественный результат одного исследования.

Для правильной оценки результатов количественного выявления антител к различным инфекционным агентам необходимо пользоваться принципом парных сывороток (повторение исследования через 2-3 недели и сравнение результатов). Такие исследования дают возможность проанализировать динамику выявления антител и, таким образом, получить необходимую информацию о развитии инфекционного процесса. Четырехкратное нарастание антител за 2-3 недели свидетельствует о развитии инфекции.

Именно для того, чтобы была возможность провести такие парные исследования и нужны количественные результаты ИФА.

Традиционный путь определения острой инфекции - выявление в сыворотке крови IgM. Современные диагностические тест - системы позволяют выявлять кроме IgM другие ранние антитела, такие как: 1) IgG к предранним белкам вирусов и 2) низкоавидные IgG. Причем IgG к предранним белкам вирусов являются маркерами как первичной острой инфекции, так и рецидива (обострения хронической инфекции) и реинфекции, т.е. всех вариантов острой инфекции, в отличие от IgM, вырабатывающихся, как правило, только при первичной инфекции.

Полимеразная цепная реакция

Введение в практику медицинской микробиологии молекулярных методов диагностики стало, безусловно, знаменательным событием, так как оно радикально расширило возможности изучения патогенеза заболеваний, принципиально усовершенствовало диагностику и даже обозначило новые подходы к лечению. Всё более распространённым становится метод молекулярной диагностики, основанный на ПЦР, дающей оптимальное сочетание высокой чувствительности и специфичности.

Молекулярная диагностика, вообще, и ПЦР в частности, основаны на определении наличия в исследуемом образце специфических нуклеиновых кислот, чаще всего ДНК.

ДНК - двунитевая (двуцепочечная) полимерная молекула, последовательность нуклеотидов в которой и определяет все свойства организма. При делении клеток ДНК удваивается, и в каждую из двух дочерних клеток попадает точная копия генетического материала родительской клетки. Удвоение молекулы ДНК называется репликацией. На двух исходных (матричных) цепях ДНК строятся новые дочерние цепи (комплементарные матричным). Репликация обеспечивается ферментативным комплексом, ключевым элементом которого является ДНК-полимераза. Для того, чтобы ДНК-полимераза сумела начать репликацию ей, помимо матрицы, необходима затравка (праймер) - небольшой фрагмент ДНК, комплементарно связанный с матрицей. Эту затравку ДНК-полимераза как бы удлиняет, строя новую цепь ДНК на имеющейся матрице. В норме в природе реплицируется вся ДНК, находящаяся в клетке или вирусе, и продуктом этого процесса являются две идентичные копии исходной ДНК.

Теперь, когда мы вкратце вспомнили самое главное о репликации, можно перейти к описанию полимеразной цепной реакции. ПЦР была открыта в 1983 году и в настоящее время широко применяется для научных и практических исследований, в области диагностики инфекционных и генетических заболеваний, ранней диагностики некоторых онкологических патологий. За открытие этого метода Кэри Мюллис в 1995 году был награжден самой престижной научной наградой - Нобелевской премией.

В ходе этой реакции тоже реплицируется ДНК, но не так, как обычно в природе. Во-первых, реплицируется не вся ДНК микроорганизма, а только ее небольшой фрагмент (мишень).

Во-вторых, продуктом ПЦР являются не две, а миллионы копий исходной мишени. Такая многократная репликация называется амплификацией.

У разных родов и видов бактерий, а также у вирусов, генетические тексты (нуклеотидные последовательности ДНК) различаются. Современные компьютерные программы содержат банк данных о расшифрованных последовательностях ДНК различных организмов. При разработке диагностической ПЦР-тест-системы находят небольшой фрагмент ДНК (мишень), строго специфичный для конкретного возбудителя. С помощью ПЦР амплифицируют именно этот участок и затем идентифицируют продукт амплификации (ампликон) методом электрофореза в агарозном геле.

Выявляя специфический для данного микроорганизма фрагмент ДНК, тем самым определяют микроорганизм.

Каждый цикл диагностики инфекций проходит в три стадии (рис.):

1. Денатурация - расплетение цепей двунитевой ДНК - не ферментативный процесс, который идет при температуре 95 0 С.
2. Присоединение (отжиг) праймеров. Для начала процесса репликации в ПЦР используют праймеры - короткие одноцепочечные ДНК (длиной 15-30 оснований), которые добавляют в избытке в реакционную смесь. Они специфично (по принципу комплементарного спаривания) присоединяются к коротким участкам, ограничивающим выбранную мишень. Эта стадия не является ферментативной и проходит в процессе инкубации реакционной смеси при 55-65 0 С. Праймеры присоединяются только к выбранным специфичным для данного возбудителя фрагментам ДНК и не взаимодействуют ни с какими другими последовательностями ДНК (а в клинической пробе очень много ДНК, как человека, так и различных микроорганизмов). Именно этим обеспечивается абсолютная специфичность диагностической ПЦР-тест-системы. Избыточное количество ДНК праймеров по отношению к матричной ДНК обеспечивает высокую чувствительность метода. То есть праймеры в исходном для ПЦР растворе со 100% вероятностью найдут мишень для присоединения.
3. В результате присоединения праймеров образуются структуры [ДНК-матрица + праймер], являющиеся «затравочными» комплексами. Начинается достраивание праймеров, начиная с 3’-концов, путём комплементарного синтеза на матрицах одноцепочечных фрагментов ДНК. Этот процесс осуществляется с помощью специального фермента - Taq-полимеразы (термоустойчивой ДНК-полимеразы) и нуклеотидов (в качестве строительного материала).

   Вновь синтезированные двуцепочечные ДНК после стадии денатурации снова связывают праймеры, которые находятся в смеси в избытке . Полученные структуры после достраивания образуют специфические фрагменты ДНК, ограниченные последовательностями праймеров. Таким образом, даже если исходной для ПЦР была только одна молекула ДНК, то в течение 25 - 40 циклов происходит амплификация, т.е. синтезируется большое количество (108-109 копий) специфических фрагментов ДНК (ампликонов), достаточное для визуального учета результата реакции после электрофореза в агарозном геле.

ПЦР проводят в циклаторе или амплификаторе - приборе, в котором циклично автоматически выполняется заданный режим смены температур, позволяющий многократно последовательно проходить 1, 2, 3 стадии.

Учёт реакции проводят с помощью электрофореза в агарозном геле. Отрицательно заряженные молекулы ДНК движутся в геле под действием электрического поля от катода к аноду, при этом длина пробега фрагментов ДНК за определенный промежуток времени зависит от их размера. ДНК в геле окрашивают бромидом этидия, что делает ее видимой в ультрафиолетовом свете. Если в исследуемой пробе в результате ПЦР накопились ампликоны (фрагменты ДНК одинакового размера), то они окажутся на одном расстоянии от старта и будут видны как полоса на гелевой дорожке. Если положение полосы на гелевой дорожке соответствует расчётной для использованной пары праймеров, т.е. находится на том же расстоянии от старта, что полоса положительного контроля, то это означает, что результат исследования положительный.

Как и в каждом эксперименте при учёте результатов ПЦР предусматривают контроли - положительный и отрицательный. Любая диагностическая тест-система должна иметь утверждённый регламент, который включает наличие упомянутых контролей.

Положительный контроль - это образец с ДНК-матрицей для накапливания специфического ампликона, соответствующего определяемому микроорганизму.

Отрицательный контроль - вода, ДНК человека или ДНК микроорганизмов, близкородственных определяемому данной тест-системой.

Достоинства метода ПЦР

ПЦР диагностика является одним из наиболее современных и совершенных лабораторных диагностических методов, позволяющий специфично выявлять ДНК единичных клеток возбудителей инфекционных заболеваний в образце.

Есть принципиальное отличие методов молекулярной диагностики, включая ПЦР, от любых других традиционных методов. Это отличие состоит в том, что традиционные методы выявляют продукты деятельности генов микроорганизмов (белки, антигены и более сложно организованные признаки), тогда как ПЦР выявляет непосредственно генетический материал. Таким образом, микроорганизм обнаруживается методом ПЦР в независимости от особенностей функционирования генома, каких-то атипичных проявлений.

Можно сказать, что ПЦР достигает предельно возможной чувствительности. Чувствительность ПЦР-тест-систем составляет 10-1000 клеток в пробе, в то время как чувствительность иммунологических и микроскопических методов - 1000-100000 клеток в пробе. Благодаря высокой чувствительности, тест-системы на основе ПЦР незаменимы в тех случаях, когда исследуемого материала (возбудителя заболевания) очень мало.

Благодаря высокой чувствительности исследование методом ПЦР позволяет осуществлять раннюю диагностику заболеваний (например, во время профилактических осмотров населения), уточнять диагноз на фоне антибиотикотерапии, проверять излеченность (эффективность проведенного лечения), а также обнаруживать персистирующие микрорганизмы. Для некоторых возбудителей, таких как Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, чувствительность диагностических ПЦР-тест-систем не должна быть высокой. Специально разрабатываются и утверждаются показатели чувствительности, начиная с 105-6 клеток в мл. Такие тест-системы выявляют диагностически значимое количество этих микроорганизмов (2,3).

При выявлении трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм патогенных микроорганизмов только прямой метод, выявляющий ДНК возбудителя, дает необходимый диагностический ответ. Другие способы диагностики (иммунологические, бактериологические, микроскопические) затруднены или даже невозможны. В случае персистирующих микроорганизмов это может быть связано с изменениями в антигенной структуре возбудителей или с переходом таких микроорганизмов в некультивируемую форму. Об этом необходимо помнить при диагностике латентных и хронических инфекций.

Высокая специфичность метода ПЦР задается нуклеотидной последовательностью праймеров и специально отрабатываемыми при создании ПЦР-тест-системы условиями их присоединения к специфическому строго для данного возбудителя фрагменту ДНК (мишени). В зависимости от выбранных праймеров ПЦР-тест-система может дифференцировать роды, виды, серотипы и даже патогенные и непатогенные штаммы микроорганизмов одного вида.

С помощью ПЦР диагностики инфекций можно определять чувствительность (или устойчивость) возбудителей ко многим из применяемых антибиотикам. Это особенно актуально в тех случаях, когда микробиологический метод исследования применить невозможно.

Для ПЦР-анализа пригоден любой клинический материал, потенциально содержащий возбудителей инфекций - кровь, сыворотка, лаважная жидкость, мокрота, слюна, желудочный сок, биопсийный материал, мазки, смывы. Исследуемым материалом могут быть пробы с объектов внешней среды (смывы, отпечатки, мазки, вода, почва и т.д.).

ПЦР является унифицированным и автоматизированным методом, что позволяет стандартно выдерживать регламент, утвержденный в разрешительных документах к использованию данной ПЦР-тест-системы и обеспечивает высокую точность и воспроизводимость результатов.

Лабораторная диагностика методом ПЦР - быстрый и надёжный способ выявления возбудителей инфекционных заболеваний. ПЦР-лаборатория даёт ответ через 48 часов с момента доставки материала на исследование. (Чистое время исследования каждого образца составляет всего несколько часов.)

В одном клиническом образце можно одновременно определять наличие более 20 возбудителей.

Важным аспектом при проведении исследования клинического образца является соблюдение правил забора и хранения клинического материала . Приведем здесь лишь некоторые общие рекомендации:

• Забор клинического материала производится из предполагаемого места обитания микроорганизмов и развития инфекции (для этого необходимо учитывать входные ворота, пути распространения, места размножения и пути выделения искомых микроорганизмов).
• Количество отделяемого в забранном материале должно быть небольшим (не больше, чем «со спичечную головку»). Избыток отделяемого, слизь и гной отрицательно влияют на качество выделения ДНК и способствуют деградации ДНК при хранении и транспортировке.
• Для забора клинического материала необходимо пользоваться только одноразовыми щеточками или тампонами. При внесении клинического материала в лабораторную пробирку с раствором соблюдать стерильность.

Актуальность молекулярной диагностики

Одним из наиболее ярких примеров, демонстрирующих актуальность молекулярной диагностики, является выявление инфицированности папилломавирусами высокого онкогенного риска. Не все папилломавирусы вызывают злокачественный рост. Различают генотипы вирусов, вызывающие рак с большой вероятностью, и так называемые доброкачественные генотипы. К первым относятся генотипы 16, 18 (распространены в нашем регионе), 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 68 (ME180), MM4 (W13B), MM7 (P291), и MM9 (P238A). К доброкачественным относят генотипы 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66, и MM8 (P155). Идентификация генотипа папилломавирусов возможна и осуществляется с помощью ПЦР (4,5).

Папилломавирусы типов 16,18 персистируют в клетках плоского эпителия шейки матки, не вызывая клинических проявлений годами (до 5 лет инкубационный период), вплоть до момента образования заметных неоплазий. Ранняя диагностика в таких случаях возможна только при профилактических обследованиях населения с использованием ПЦР. В случае обнаружения ДНК папилломавирусов типов, вызывающих рак с большой вероятностью, пациенту следует обратиться к врачу онкологу, посещать его 1 раз в месяц, следить за клиническими проявлениями. Таким образом, ПЦР в этом случае даёт возможность осуществлять раннюю диагностику, позволяющую предотвратить или не запустить рак шейки матки.

В целом ряде случаев на определённых этапах заболевания возбудителей не удаётся выделить классическими микробиологическими методами. Это происходит в силу того, что микроорганизмы могут находиться внутри эпителиальных клеток, в тканях или слизи (например, для хламидий, микоплазм, уреаплазм, всех вирусов характерна внутриклеточная локализация, а трихомонады и гонококки могут находиться как внутри- так и внеклеточно). Кроме того, некоторые бактерии под влиянием определённых факторов могут переходить в так называемые некультивируемые формы или некультивируемое состояние. Примером может служить научно-медицинское исследование хламидиоза. Сравнивали продолжительность выявления Chlamydia trachomatis в очаге инфекции с помощью методов культуры тканей, прямой флуоресценции, ПЦР (выявление ДНК) и Вестерн-блота (выявление РНК). Установлено, что методы определения нуклеиновых кислот обнаруживают возбудителя в очаге на 4 недели дольше (16 недель против 12 недель после первичной инфекции), чем традиционные методы. В этой работе сделан вывод о возможности перехода хламидий в ходе инфекционного процесса в некультивируемое состояние. В этом состоянии хламидии продолжают вызывать воспаление или персистируют в клетках эпителия, но не выявляются микробиологическим методом (6).

В настоящее время накоплен очень большой материал, свидетельствующий об актуальности молекулярной диагностики, но мы не можем рассматривать другие примеры в силу ограниченности объёма данной публикации.

Стратегия использования методов лабораторной диагностики

На современном этапе развития лабораторной диагностики инфекционных заболеваний очевидна необходимость комплексного подхода, который заключается в использовании различных лабораторных методов для установления этиологического диагноза инфекционного заболевания. Врач решает вопрос об использовании того или иного метода лабораторных исследований после изучения анамнеза и клинических проявлений. Разные сочетания методов используют в зависимости от особенностей биологии возбудителей и их взаимодействия с иммунной системой человека, а также от формы заболевания.

Например, для лабораторной диагностики хламидий, вирусов герпес-группы, токсоплазм анализируют результаты ПЦР- и ИФА-исследований. А при лабораторной диагностике микоплазмоза и уреаплазмоза используют сочетание ПЦР с выделением культур с определением чувствительности к антибиотикам. Для выявления неспецифической условно-патогенной микрофлоры используют микроскопию мазка и микробиологический метод выделения культур.

Врач-клиницист ставит диагноз на основании изучения анамнеза пациента, клинических проявлений и данных лабораторной диагностики.

Литература:

• Инфекции, передаваемые половым путем, №2, стр. 21-24, 2002 год. Урогенитальная хламидийная инфекция. Подходы к диагностике и терапии. Г.А. Дмитриев, ЦНИКВИ МЗ РФ, Москва.
• Учебное пособие. Всероссийский учебно-научно-методический центр по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию. Москва, 1999 год. Микроэкология влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных дисбактериозах. В.М. Коршунов,…Л.И. Кафарская,…В.В. Смеянов. МЗ РФ, РГМУ, МИМСР, РМАПО, Москва.
• Инфекции, передаваемые половым путем, №1, стр. 8-15, 2002 год. Современное состояние вопроса о значении Ureaplasma urealiticum в генезе урогенитальных заболеваний. В.И. Кисина, О.С. Загребина, К.И. Забиров, В.В. Мешков. ЦНИКВИ МЗ РФ, ГКБ №47 МЗ, Москва.
• Канцерогенез. Коллекив авторов под редакцией Д.Г. Заридзе. Научный мир, 2000 год, Москва. Вирусы папиллом и их роль в канцерогенезе шейки матки. Ф.Л. Киселев. Онкологический Научный Центр РАМН.
• Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы). Справочник, под редакцией проф.А.И. Карпищенко, 2001 год, «Интермедика», Санкт-Петербург.
• Infect. Immun., May 1992, 2040-2047, Vol 60, No. 5. Demonstration of chlamydial RNA and DNA during a culture-negative state. SM Holland, … HR Taylor. Division of Infectious Diseases, Johns Hopkins Hospital, Baltimore, Maryland.

Для проведения ПЦР могут быть использованы различные биологические материалы, в которых могут содержаться микробы или их фрагменты.

Для выявления инфекций половых органов у мужчин и женщин, для анализа берутся выделения из половых органов, мазок из мочеиспускательного канала, мазок из шейки матки, а также моча.

Для диагностики вирусного гепатита С и ВИЧ инфекции на анализ берут кровь.

Для диагностики инфекционного мононуклеоза может быть использован мазок из зева.

Перед обследованием обязательно уточните у вашего врача, какие именно материалы будут использованы для анализа.

Толкование и расшифровка результатов ПЦР

Возможны следующие результаты ПЦР анализа:

Отрицательный результат – означает, что в биологическом материале, который был подвержен исследованию, не было обнаружено никаких следов инфекции. В большинстве случаев отрицательный результат анализа ПЦР говорит о том, что в организме человека нет инфекции, следы которой пытались обнаружить при помощи обследования.

Положительный результат – означает, что в биологическом материале, который был подвержен исследованию, были обнаружены следы инфекции. Положительный результат ПЦР с большой степенью точности указывает на наличие той или иной инфекции.

Насколько точна ПЦР диагностика инфекций?

Метод ПЦР отличается высокой точностью, специфичностью и чувствительностью. Это означает, что данный анализ способен:

1. точно определить наличие или отсутствие инфекции;
2. точно указать, что именно это за инфекция (специфичность);
3. обнаружить инфекцию даже при очень низком содержании ДНК микробов в биологическом материале, который был подвергнут исследованию (чувствительность).

В отличие от иммуноферментного анализа (ИФА) и других иммунологических методов диагностики инфекции, ПЦР гораздо реже дает ложно-отрицательные результаты (анализ показывает отсутствие инфекции в то время когда на самом деле она есть) и практически никогда не дает ложно-положительные результаты (анализ показывает наличие инфекции в то время когда на самом деле ее нет).

ПЦР, или иначе полимеразная цепная реакция, представляет собой метод лабораторной диагностики различных инфекционных заболеваний.

Этот метод разработал Кэри Мюллис еще в 1983 году. Первоначально ПЦР использовали лишь в научных целях, но через некоторое время он был внедрен и в сферу практической медицины.

Суть метода сводится к выявлению возбудителя инфекции во фрагментах ДНК и РНК. Для каждого возбудителя имеется свой эталонный фрагмент ДНК, который запускает создание большого числа его копий. Он сравнивается с имеющейся базой данных, содержащей сведения о строении ДНК разных видов микроорганизмов.

При помощи полимеразной цепной реакции можно не только выявить инфекцию, но и дать ей количественную оценку.

Когда применяется ПЦР-диагностика?

Анализ биологического материала, проводимый при помощи ПЦР, помогает обнаруживать различные урогенитальные инфекции, в том числе и скрытые, которые не проявляют себя особыми симптомами.

Данный метод исследования позволяет выявить у человека следующие инфекции:

• вирус простого герпеса обоих типов;
• ВИЧ-инфекцию;
• хламидиоз;
• уреаплазмоз;
• кандидоз;
• микоплазмоз;
• трихомониаз;
• а также гепатиты В и С, туберкулез, хеликобактериоз, инфекционный мононуклеоз.

При подготовке к беременности и во время нее женщине обязательно назначается проведение ПЦР диагностики различных половых инфекций.

Биологический материал для ПЦР-исследования

Для выявления инфекций методом ПЦР могут использоваться:

• моча, мазок из цервикального канала (у женщин), мазок из мочеиспускательного канала, выделения из половых органов – для исследования на половые инфекции;
• кровь – для исследования на ВИЧ-инфекцию и гепатита С;
• мазок из зева – для исследования на инфекционный мононуклеоз.

Преимущества и недостатки ПЦР-диагностики инфекций

К достоинствам анализов на инфекции, проводимых методом ПЦР относят:

1. Универсальность - когда другие методы диагностики оказываются бессильными, ПЦР обнаруживает любые РНК и ДНК.
2. Специфичность. В исследуемом материале при помощи данного способа выявляется типичная для конкретного возбудителя инфекции последовательность нуклеотидов. Полимеразная цепная реакция дает возможность выявления в одном и том же материале нескольких разных возбудителей.
3. Чувствительность. Инфекция при использовании данного метода обнаруживается, даже если ее содержание очень незначительно.
4. Оперативность. На выявление возбудителя инфекции уходит совсем немного времени - всего несколько часов.
5. Кроме того, полимеразная цепная реакция помогает выявлять не реакцию организма человека на проникновение в него патогенных микроорганизмов, а конкретного возбудителя. Благодаря этому можно обнаружить у пациента заболевание еще до того, как оно начнет проявлять себя конкретными симптомами.

К «минусам» данного диагностического метода относят необходимость строгого соблюдения требований оснащения лабораторных помещений фильтрами высокой степени очистки, чтобы не произошло загрязнение взятого для анализа биологического материала фрагментами ДНК других живых организмов.

Иногда анализ, выполненный с помощью ПЦР, может дать отрицательный результат при наличии явных симптомов определенного заболевания. Это может указывать на несоблюдение правил сбора биологического материала.

В то же время положительный результат анализа не всегда является свидетельством того, что у пациента присутствует конкретное заболевание. Так, например, после проведенного лечения уже погибший возбудитель в течение определенного времени дает положительный результат ПЦР-анализа.